Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
Рис. 2. Схема двуступенчатого рекомбинационного процесса, происходящего при обмене аллельных последовательностей между двумя репликонами. Одна из двух аллельных последовательностей сцеплена с генетическим маркером, фенотип которого можно легко обнаружить у Е. coli. Отбор интегратов проводят в таких условиях, в которых одна из двух точек начала репликации не функционирует. Остальные подробности приведены в тексте.
зом, реконструкция геномной области возможна. Более общий подход предполагает обмен аллельными последовательностями между двумя репликонами, происходящий in vivo в результате двойной рекомбинации. Двойные рекомбинации, однако, наблюдаются крайне редко, и такой подход применим только при наличии подходящего метода селекции. К счастью, известен ряд приемов, позволяющих преодолеть эту трудность за счет разделения двойного рекомбинационного события на стадии интеграции и вырезания (рис. 2). Если есть возможность проводить селекцию последовательно на обеих стадиях рекомбинации, то эффективность обмена аллельными последовательностями между двумя репликонами будет зависеть только от расположения мутации относительно точек соединения (А и В) вектора со вставкой. Большинство подобных методов требует, чтобы один из репликонов нес пригодный для селекции маркер и участок начала репликации, блокирующийся при определенных условиях (рис. 2). Отбор интегратов осуществляют путем селекции по этому маркеру в условиях, когда участок начала репликации блокирован. Селекцию на стадии вырезания проводят различными методами, зависящими от типа применяемых репликонов и маркеров, —• эта техника подробно описана в приложении к работе [16].
В большинстве случаев аллельные последовательности, обмен которыми между двумя репликонами необходимо произвести, не имеют фенотипического проявления в Е. coli. В та-
Генетические маркеры для селекции индуцированных мутаций
185
ких случаях рекомбинантные клоны, содержащие нужный аллель, можно идентифицировать, только проведя анализ нуклеотидной последовательности большого числа клонов. Вот почему удобно пометить предназначенный для обмена участок ДНК каким-либо генетическим маркером, легкообнаруживае-мым у Е. coli. Для этого можно использовать любой из описанных выше маркеров, а также маркеры устойчивости к антибиотикам.
Недавно нами разработана методика, позволяющая переносить мутации из клонированных в плазмиде небольших фрагментов ДНК в большие геномные фрагменты, клонированные в Я-векторах. Она основана на селекции двойных рекомбинационных событий и идентификации делеций по их способности вызывать сдвиг рамки в гене, который кодирует полипептид с легкообнаруживаемым фенотипом. Как уже упоминалось в разделе 1 этой главы, Трабони с соавт. [7] описали метод селекции мутантов со сдвигом рамки на примере коротких последовательностей, введенных во фрагмент ДНК, который кодирует а-пептид р-галактозидазы. Мы покажем, как эти мутации можно ввести в их исходное генетическое окружение при помощи двустадийного рекомбинационного процесса: интеграции и последующего вырезания несущей такую мутацию плазмиды в геном рекомбинантного фага, содержащего полноразмерную копию клонированного гена. Применимость метода, однако, не ограничивается мутациями сдвига рамки. Если уже имеется тест-плазмида с небольшой делецией, сдвигающей рамку считывания р-галактозидазы, то любая замена основания в последовательности, затронутой делецией, может заменить эту делецию в исходном генетическом окружении. Фаги, несущие после интеграции—вырезания делецию или замену основания, можно идентифицировать соответственно по их способности или неспособности вызывать сдвиг рамки в тест-плазмиде. Все стадии этого метода (интеграция, вырезание, тест на присутствие мутации) позволяют проводить селекцию либо предполагают возможность скрининга.
Схема метода приведена на рис. 3. Хотя данный метод разработан для работы с фрагментами ДНК, не имеющими фенотипического проявления в Е. coli, мы проиллюстрируем его на примере последовательности, придающей бактерии-хозяину устойчивость к тетрациклину. Рекомбинация осуществляется между плазмидой и фагом К, несущим замену i21. Плазмида pUC8-91/3 (PuCb на рис. 3) представляет собой вектор pUC8, в который введен фрагмент длиной 91 п. н., полученный после расщепления Sau3A гена устойчивости к тетрациклину pBR322
[17]. Введение этих 3N+1 нуклеотидов в ген, кодирующий а-пептид ?5-галактозидазы, нарушает трансляционную рамку считывания и синтез активного а-пептида. Плазмида pUC8-91/3
Бесцветная
колония
D D b
О оо
Только бесцветные колонии
Синие и бесцветные колонии
Рис. 3. Схема эксперимента по переносу мутации (Ь*) из небольшой плазмиды в фаг Я. Кольцевые и линейные структуры представляют соответственно плазмиды и фаги; буквами а, Ь и с обозначены участки исследуемого гена. Цифры 1—4 обозначают стадии методики: 1. Отбор мутаций со сдвигом рамки (во вставке Ь), восстанавливающих правильное считывание гена, кодирующего а-пептид фермента §-галактозидазы. Селекция возможна благодаря тому, что эта мутация приводит к изменению фенотипа — появлению синих колоний.
