Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
MCB, Omnisolve МХ1456
ДТТ (DTT) Calbiochem, La Jolla, CA 233155
Ацетат калия Aldrich 24,038-9
Перегнанный глицерин BRL, Gaithersburg, MD 5514UA
Alpha 13797
>) Продукция приведенных фирм дает стабильно высокие результаты в лаборатории
автора. Из этого, однако, не следует, что продукция других поставщиков в результате
проверки оказалась неудовлетворительной.
11—196
Таблица 12. Среды
A. SOB
Бакто-триптон 2%
Дрожжевой экстракт 0,5%'
NaCl Ю мМ
КС1 2,5 мМ
MgCI2 Ю мМ
Mg-S04 Ю мМ
SOC
Среда SOC идентична среде SOB, но содержит дополнительно 20 мМ
глюкозы.
Приготовление сред SOB и SOC
Растворите триптон, дрожжевой экстракт, NaCl и КС1 в воде максимально возможной чистоты и проавтоклавируйте 30—40 мин. Раствором можно пользоваться в течение 2—3 нед. Приготовьте 2М раствор Mg2+, содержащий 1 М MgCl2 и 1 М MgS04. Простерилизуйте фильтрованием через мембрану с порами 0,22 мкм. Аналогично приготовьте 2 М раствор глюкозы и храните его при —20 °С. Перед использованием добавьте в среду Mg2+ (и глюкозу для среды SOC) и простерилизуйте фильтрованием. pH раствора 6,8—7,0.
Б. Х-бульон (ХЬ)
Бакто-триптон 2,5%
Дрожжевой экстракт 0,75%
MgS04 20 мМ
Трис pH 7,5 50 мМ
Диаминопимелиновая кислота (ДАП) 100 мкг/мл
Тнмидин 50 мкг/мл
Приготовление
Растворите триптон и дрожжевой экстракт в максимально чистой воде. Проавтоклавируйте 30—40 мин. Приготовьте раствор 2 М MgS04, 2М трис pH 7,5 и ЮОХраствор, содержащий ДАП (1 мг/мл) и тимидин (0,5 мг/мл). Простерилизуйте фильтрованием через мембрану с порами
0,22 мкм. Перед использованием добавьте к неполной среде остальные реагенты.
В. Среда LB
Бакто-триптон 1%
Дрожжевой экстракт 0,5%
NaCl 1%
Среда LM’)
Бакто-триптон 1%
Дрожжевой экстракт 0,5%
NaCl 10 мМ
MgCl2 10 мМ
Г. Среда NZY
NZ амин 1%
Дрожжевой экстракт 0,5%
NaCl 0,5%
MgSOt 10 мМ
Методы трансформации Е. coli
163
Продолжение
Д. Среда Psi
Бакто-триптон
2%
0,5% 20 мМ
10 мМ
Дрожжевой экстракт
КС1 pH 7,6
Доведите КОН
5 мМ
‘) LM в описанных здесь методиках используется для селекции на твердых средах. Твердая среда SOB применяется главным образом для получения колоний, идущих на приготовление компетентных клеток.
бы выяснить, какой из них содержит ингибирующую примесь. Поставщики реактивов, используемых автором, . перечислены в табл. 11, что дает возможность исследователю сравнить применяемые им реагенты с теми, качество которых проверено опытом.
Проблема чистоты реактивов относится в первую очередь к высокоэффективным методикам с применением органических растворителей. Простые методики значительно менее чувствительны к загрязнениям. Как правило, узким местом в высокоэффективных методиках является низкое качество воды и ДМСО. Этот вопрос обсуждается ниже. Другие реактивы, качество которых может влиять на результаты, — это MES, глицерин (для методик с замораживанием) и дитиотрейтол. Единственный путь поиска некачественного реактива или материала состоит в поочередной замене компонентов. Возможные причины неудач в опытах по трансформации обсуждались в разд. 4.2.
Загрязнение воды может привести к непредсказуемым результатам. В некоторых регионах для приготовления TFB можно использовать водопроводную воду, тогда как в других местах даже дважды дистиллированная вода дает плохие результаты. Самую надежную очистку воды можно провести при помощи системы обратного осмоса (Millipore согр.), эффективно удаляющей органические загрязнения. Пригодность для трансформации полученной с помощью этой системы воды падает по мере насыщения патрона, удаляющего органические примеси, даже если проводимость воды остается очень низкой. Тот факт, что дистиллированная вода иногда оказывается непригодной, можно объяснить наличием в ней ингибирующих трансформацию примесей, близких по летучести к воде. Этот эффект наблюдается только для методик с применением органических растворителей, что указывает на взаимодействие последних с органическими примесями в воде, в результате которого образуются вещества, неблагоприятно влияющие на трансформацию. Для удаления предполагаемых загрязнений
