Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
12—196
ATG
jSa/nHI Hint I I Pstl
1 II
Достроенный Bam Hl-cain
Hinf I
I
Pstl
I!
Мишень р-галактоэидаза мутагенеза (неправильная рамка считывания)
R78B (образует бесцветные
бляшки)___________
Мишень р-галактозидаза мутагенеза (правильная рамка)
R78Bo (образует синие _______________бляшки-)___________,
Одноцепочечную ДНК, полученную из R78B, отжигают с Pstl Hinfl-фрагментом R7BBo
EcoRI
ATG
Расщепляют Pstl viHinf I, выделяют фрагмент и отжигают с одноцепочечной ДНК R78В
50
Thr^ Mef_ lie Thri 7,0 ,
AC? AJS. ACG ML I?L AGC TTG GCC.GAA CCG GGG ATT ЙМ CCC_ GGG. ACC¦»»,.
(
''....TCT
BamHl
^ f Aspj>er TJr^J^ys
CGC ACC CAA У&. GAG AAT CAT ACC ACT AGA CCA TTC GGC. CG G АтГкГсОА~ССТ GCA
OTA TOO TOA TCT GOT AAO CCG ОС С TAG GCA GCT 00
3 f c_0
Hinf 1
ТА
Фрагмент Кленова + dCTP dTTP dATP
20
30 (
AAaIcGAGAATCATaCCAC-CTCTT AOTATOGTO-
j Обратная I транскриптаза + I dGTP
AAA&GAfiAATCATACCAC-• mOTCTTAGTATGGTG-
-У
-5'
-3'
-5'
1
¦ dCTP, dATP, dTTP,
aaaIgIcgagaatcataccac------
ТТЩСОТСTTAOTA TOGTG------v.
Трансформация
-3'
-5'
i
t5'
Pstl
ААа&басаатсатассас
ТТТЩИСТСТТМТАГбОТб
Дикий ш
limit)
aaaHcgagaatcatacca:
TTTWCTCTTAOTATOGTQ
MwtitiT
(сщше бшшжи)
Генетические маркеры для селекции индуцированных мутаций
179
Таблица 1. Выделение одноцепочечной ДНК фага ЛИЗ из инфицированных бактерий
Геном фага MI3 представлен кольцевой молекулой одноцепочечной ДНК и упакован в палочковидный вирион. Фаг секретируется клеткой-хозяином в среду, где титр его может достигать 1012 вирионов/мл. После центрифугирования зараженной фагом культуры бактерий одноцепочечную ДНК нетрудно выделить из небольшого объема надосадка. Полученная таким путем ДНК пригодна для определения нуклеотидной последовательности и для экспериментов по направленному мутагенезу.
1. При помощи стерильной пастеровской пипетки засейте свежей бляшкой фага 1,5 мл компетентной бактериальной культуры. Проинкубируйте с аэрацией 6 ч при 37 °С.
2. Перенесите культуру в пробирку для микроцентрифуги и центрифугируйте 5 мин.
3. Перенесите надосадок в новую пробирку, не стараясь собрать его полностью. Если надосадок хранился более 1 дня, перед использованием от-центрифугируйте его заново.
4. Добавьте 200 мкл 2,5 М NaCl, 20% полиэтиленгликоля 6000. Проинкубируйте 15 мин при комнатной температуре.
5. Отцентрифугируйте 3 мин. Удалите надосадок пастеровской пипеткой. Отцентрифугируйте еще раз (недолго). Удалите следы надосадка пастеровской пипеткой с оттянутым концом.
6. Добавьте 100 мкл 10 мМ трис-НС1 pH 8,0; 1 мМ ЭДТА и растворите осадок. Добавьте 100 мкл фенола, насыщенного 100 мМ трис-НС1 pH 8,0, 10 мМ ЭДТА и экстрагируйте белки, осторожно перемешивая.
7. Отцентрифугируйте 1 мин. Отберите около 80 мкл водной фазы в новую микроцентрифужную пробирку.
8. Добавьте 20 мкл 5М перхлората натрия и 50 мкл изопропанола.
9. Осадите 15 мин в микроцентрифуге. Осадок может быть невидимым.
10. Удалите надосадок пипеткой с оттянутым концом и растворите осадок в 100 мкл 0,3 М ацетата натрия.
11. Добавьте 300 мкл охлажденного во льду этанола. Проинкубируйте 5 мин в смеси сухого льда с этанолом.
12. Отцентрифугируйте 15 мин. Растворите осадок в 30 мкл 10 мМ трис-НС1 pH 8,0, 0,1 мМ ЭДТА.
синий цвет [2]. Методика получения затравки приведена в табл. 2. Из R78Bo был выделен Ps/I-ЯшП-фрагмент, который и отжигали с одноцепочечной R78B. Разница в последовательностях между матрицей и затравкой (обусловливающая сдвиг рамки) находится вне кодирующей области тРНКРго. Мы намеревались заменить остаток G в положении 31 остатком С. Присутствие остатков G в положениях 27 и 29, то есть между
Рис. 1. Селекция замен оснований, индуцированных in vitro с помощью обратной транскриптазы. Сплошной линией обозначена последовательность вектора М13. Заштрихованные прямоугольники — кодирующие последовательности р-галактозидазы. Косой штриховкой в R78B обозначена кодирующая последовательность с рамкой считывания, смещенной в результате введения последо-вательности-мишени для мутагенеза. Плазмида R78Bo — производная R78B, в которую путем достройки участка расщепления ВатШ добавлены четыре основания; вследствие этого восстанавливается правильная рамка считывания р-галактозидазы (прямая штриховка). Подробности приведены в тексте.
