Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
11*
164
Глава 6
Таблица 13. Очистка водьг
1. Колбу Эрленмейера объемом 2—4 л тщательно прополоскайте водой.
2. Заполните колбу водой до половины. Пригодна любая вода — водопроводная, деионизованная, дистиллированная или очищенная на системе Mill Q.
3. Добавьте активированный уголь 100—325 меш (1% по массе в воде).
4. Поставьте на магнитную мешалку и перемешивайте 1—2 дня. Колбу можно закрыть неплотно алюминиевой фольгой или небольшим стаканчиком.
5. Профильтруйте воду через бумажный фильтр для удаления угля. Полученную воду можно использовать для приготовления буферов для трансформации и т. п.
полезно обрабатывать воду активированным углем. После такой обработки на совершенно непригодной до этого воде можно приготовить прекрасные растворы для трансформации. Если высокоэффективной трансформации добиться не удается, попробуйте очистить воду этим методом (приведен в табл. 13).
ДМСО подвергается окислению с образованием диметил-сульфона и диметилсульфида, а диметилсульфид — это мощный ингибитор трансформации. По-видимому, именно этим объясняется важно'сть высокого качества ДМСО, а также тот факт, что хороший ДМСО при хранении рано или поздно становится непригодным. О качестве ДМСО судят по увеличению частоты трансформации, которое имеет место при его добавлении. Частота трансформации в присутствии ДМСО должна быть в 10—20 раз выше, чем без него. Хранить ДМСО можно различными способами. Во-первых, можно подобрать фирму, которая поставляет качественный перегнанный, спектрально чистый ДМСО, приобретать его небольшими порциями и расфасовывать по небольшим полипропиленовым пробиркам. Каждую пробирку заполняют ДМСО доверху и хранят при —20 или —70 °С. Размороженную пробирку используют в течение 1 дня и выбрасывают. При использовании раствора ДМСО-1-+ДТТ необходимо разделить его на аликвоты так, чтобы каждая пробирка подвергалась замораживанию и оттаиванию менее 5 раз. Хранение при —70 °С может затормозить окисление.
Другой способ (его можно применять в сочетании с первым) заключается в том, что перед применением ДМСО через него пропускают газообразный азот в течение 30—60 мин. При этом, по-видимому, происходит удаление диметилсульфида и пригодность ДМСО для работы восстанавливается.
6. Оценка результатов трансформации
Несколько приводимых ниже стандартных контролей позволяют достаточно полно оценить ход и результаты трансформации.
Методы трансформации Е. coli
165
6.1. Фаза роста клеток
Максимальная эффективность трансформации достигается тогда, когда используемые клетки находятся на среднепоздней стадии логарифмического роста. Пока собранная культура охлаждается во льду, определите в ней титр жизнеспособных клеток. Сделать это можно, разведя 10 мкл культуры в 1 мл среды, 10 мкл этого 'разведения (в 102 раз) 'в 1 мл среды (раз-ведение в 104 раз) и рассеяв 10 мкл этого разведения на чашке с полноценной агаризованной средой без антибиотиков. Общее разведение клеток— 106 раз, так что 50 колоний на чашке будут соответствовать титру 5-107 клеток/мл. Для большинства штаммов Е. coli титр клеток должен находиться в пределах 4— 8-107 клеток/мл. Если титр клеток значительно отличается от этой цифры, эффективность трансформации может оказаться низкой. Обычно титр клеток оценивают по оптической плотности ОП550 (в действительности представляющей собой светорассеяние) при помощи спектрофотометра. Для каждого прибора необходимо определить соотношение между оптической плотностью и титром жизнеспособных клеток в культуре, так как для спектрофотометров разного типа (и разных штаммов Е. coli) это соотношение меняется.
6.2. Частота трасформации
Частоту трансформации (или эффективность трансформации, ЭТ) определяют по стандартной ДНК (например, pBR322), добавляемой в количествах, значительно меньших, чем насыщающие. Эта величина определяет, насколько эффективно плазмида проникает и «устраивается» в индивидуальной компетентной клетке. При высокоэффективной методике для каждой реакции трансформации берут 10—100 пг ДНК pBR322. Аликвоты реакционной смеси рассевают на чашках и определяют эффективность трансформации. Если, например, при трансформации 10 пг ДНК pBR322 на чашках, засеянных 1%-ной и 10%-ной реакционной смесью, появляются соответственно 10 и 100 колоний, ЭТ составляет Ы08 колониеобразующих единиц (к. о. е.) на 1 мкг pBR322. Для менее эффективных методик берут 1 нг pBR322 и рассевают 1%-ное и 10%-ное разведение. В этом случае 10 колоний на 1%-ной чашке и 100 колоний на 10%-ной соответствуют эффективности трансформации МО6 к. о. е./мкг.
6.3. Доля компетентных клеток
Важнейший параметр при оценке результатов трансформации— доля клеток, оказавшихся компетентными. Обычно она составляет 0,01—10% от общего числа жизнеспособных клеток
166
Глава 6
в культуре. Доля компетентных клеток определяет полный колониеобразующий потенциал данного препарата и измеряется с использованием насыщающих концентраций плазмидной ДНК (обычное соотношение числа плазмид и числа клеток — 200:1). Так, для трансформации Ю8 клеток следует взять >2-1010 молекул плазмиды (100 нг pBR322). Для проверки на 1 трансформацию берут 200 нг pBR322, 10 мкл вносят в 1 мл среды (разведение в 102 раз), 10 мкл этого разведения снова разводят в 100 раз и высевают 1 и 10% этого разведения на чашки с богатой селективной и неселективной средой. Долю компетентных клеток определяют, сравнивая число колоний, выросших в селективных и неселективных условиях. Для стандартной высокоэффективной методики доля компетентных клеток должна составлять не менее 5%.
