Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
6.4. Влияние компонентов и добавок
Методики, в которых используются различные добавки, можно проверить, сравнивая эффективность трансформации (и долю компетентных клеток), получающуюся в присутствии и в отсутствие добавок. ДМСО должен повышать эффективность в 10—20 раз, а ДТТ — в 2—4 раза. Если титр клеток значительно отличается от оптимального, эти величины становятся заметно ниже. Поэтому при постановке контролей следует определять титр клеток.
Компоненты буфера для трансформации лучше всего проверять, заменяя их аналогичными, но полученными из другого источника. Стоит попробовать обычную водопроводную воду (аэрированную для удаления хлора) вместо бидистиллирован-ной или очищенной обратным осмосом. Воду из любого источника можно очистить активированным углем (табл. 6.13). Компоненты буфера можно удалять поодиночке, сравнивая получающиеся результаты с данными рис. 1 из работы [15].
Контроли можно разделить на два типа: используемые постоянно и ставящиеся при возникновении неполадок. Определять титр жизнеспособных клеток и эффективность трансформации следует в каждом опыте. Это помогает установить причину низкой эффективности трансформации. Если титр клеток, например, составил 5-108, а ЭТ — 2-107 (по высокоэффективной методике), то причина малой эффективности — слишком высокий титр клеток. Остальные контроли ставят, если трансформация недостаточно эффективна постоянно. По опыту автора последовательная замена компонентов позволяет достаточно надежно идентифицировать и устранить источник затруднений.
Методы трансформации Е. coli
167
7. Практические замечания
Ниже кратко описано несколько используемых при трансформации практических приемов.
7.1. Рассев клеток
Клетки, обработанные согласно методике трансформации, несколько ослаблены, поэтому сразу после трансформации с ними следует обращаться осторожно. Для того чтобы рассеять клетки, нанесите на чашку 150 мкл среды в виде капли, затем в эту каплю внесите нужное количество клеток. (Этого не требуется, если клетки рассевают в объеме >200 мкл). Осторожно, но быстро распределите суспензию по чашке изогнутой пастеровской пипеткой. Автор использует для этого вращающийся круг. Чашка медленно поворачивается, а слегка опирающаяся на нее L-образная пастеровская пипетка равномерно втирает суспензию клеток в агар.
Если на чашку необходимо посеять весь объем реакции трансформации или же трансформационную смесь из нескольких пробирок, клетки лучше всего осадить центрифугированием при 600—800 g в течение 5 мин, удалить надосадок и суспендировать их в 200—300 мкл среды, осторожно набирая и выпуская жидкость из пипетки.
7.2. Рассев в верхнем слое агара
Трансформационную смесь из одной или нескольких пробирок можно легко посеять на одну чашку, используя верхний слой агара. Для этого среду SOB (табл. 12), содержащую 1% агара, расплавляют и поддерживают в жидком виде при 42—45 °С. Два миллилитра этого агара добавляют к суспензии клеток, перемешивают и выливают на чашку. После застывания верхнего слоя чашку переносят на 37 °С и инкубируют до появления колоний. Чтобы верхний слой агара не застыл, не успев равномерно распределиться по чашке, чашку и трансформационную смесь необходимо перед рассевом подогреть до 37 °С.
7.3. Тепловой шок
Стадия теплового шока входит во все методики трансформации Е. coli. Оптимальное время шока зависит кроме других параметров от соотношения поверхности к объему суспензии клеток и от теплопроводности пробирки. Если трансформацию проводят препаративно или если вместо полипропиленовых
Глава 6
пробирок используют пробирки из другого материала, оптимальное время инкубации при 42°С следует подобрать экспериментально.
7.4. Хранение трасформированных клеток
После инкубации при 37 °С в течение 1 ч трансформированные клетки можно хранить в течение ночи при 4°С. При использовании для инкубации клеток среды SOC (табл. 12) титр трансформированных клеток через 12 ч падает примерно на 10%. Жизнеспособность трансформированных клеток повышается в присутствии 20 мМ глюкозы. Если клетки необходимо сохранить дольше, их следует отмыть от трансформационного буфера. Добавьте к клеткам 2 мл среды SOC и осадите их при 800 g. Удалите надосадок и мягко суспендируйте клетки в среде SOC. Даже после нескольких дней хранения при 4°С титр клеток падает менее чем на 10%.
Для сохранения трансформированных клеток в течение долгого времени разбавьте трансформационную смесь вдвое смесью среды SOB с глицерином (3 : 2) так, чтобы конечная концентрация глицерина составила 20%, перенесите в пробирки с завинчивающимися крышками, охладите во льду, быстро заморозьте в жидком азоте и храните замороженную культуру при —70 °С. После оттаивания титр клеток составит >90% исходного.
8. Специальные случаи
8.1. Клонирование кДНК
Получение на основе мРНК двухцепочечной кДНК и введение ее в нужный плазмидный вектор — в целом сложный и малоэффективный процесс, поэтому для конструирования представительной библиотеки обычно имеется лишь небольшое количество исходной кДНК. В связи с этим колониеобразующий потенциал кДНК необходимо использовать с максимальной эффективностью. Для этого требуются высокоэффективные методы трансформации, высокая доля компетентных клеток в трансформационной смеси и условия, позволяющие достигнуть как максимального общего числа колоний, так и наибольшей возможной плотности колоний на каждой чашке. Сочетать два последних требования не всегда просто, так как максимальное общее число колоний достигается при трансформации очень малыми количествами ДНК, что увеличивает необходимое число отдельных реакций трансформации. В то же время на чашку диаметром 100 мм можно посеять лишь объем, соответствующий двум реакциям трансформации.
