Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
3. Проинкубируйте при 37 °С с умеренным встряхиванием до тех пор, пока титр культуры не достигнет 6—9 • 107 жизнеспособных клеток/мл.
4. Перенесите культуру в полипропиленовые центрифужные пробирки объемом 50 мл (например, пробирки Falcon 2070) и охладите во льду 10—15 мин.
5. Осадите клетки центрифугированием при 750—1000 g (2000— 3000 об/мин) в течение 12—15 мин при 4°С. Тщательно удалите остатки жидкости, постучав перевернутой пробиркой по бумажному полотенцу. Оставшиеся капли можно удалить микропипеткой.
6. Суспендируйте клетки в буфере для замораживания (FSB)‘> (1/з исходного объема культуры) на встряхивателе при небольшой скорости. Проинкубируйте 10—15 мин во льду.
7. Осадите клетки и удалите надосадок так же, как на стадии 5.
8. Ресуспендируйте клетки в FSB (Vi2,5 исходного объема культуры). При этом 2,5 мл исходной культуры сконцентрируется до 200 мкл.
154
Глава 6
П родолжение
9. Добавьте ДМСО до 3,5% (по объему), т. е. 7 мкл на 200 мкл суспензии клеток. Добавляйте ДМСО в центр суспензии и сразу перемешивайте, вращая пробирку 5—10 с. Проинкубируйте 5 мин во льду.
10. Добавьте вторую аликвоту ДМСО до конечной концентрации 7%, Проинкубируйте во льду 10—15 мин. (В этой методике ДТТ не используется.)
11. Разлейте по 210 мкл в охлажденные полипропиленовые пробирки с завинчивающимися крышками или в 1,5 мл микроцентрифужные пробирки.
12. Быстро заморозьте клетки в смеси сухого льда с этанолом или в. жидком азоте и оставьте там на несколько минут.
13. Храните пробирки при — 70 °С или в жидком азоте.
Б. Использование замороженных клеток
1. Достаньте пробирку из холодильника и выдержите на воздухе при комнатной температуре. Как только суспензия клеток оттает, перенесите пробирку в лед. (Если клетки были заморожены в большом объеме, разлейте их в отдельные пробирки по 200 мкл.)
2. Добавьте раствор ДНК в объеме <20 мкл. Размешайте ДНК, вращая пробирку между ладонями.
3. Проинкубируйте пробирку во льду 10—60 мин.
4. Поместите пробирку в водяную баню с температурой 42 °С на 90 с (тепловой шок), затем быстро охладите до 0°С (во льду).
5. Добавьте 800 мкл среды SOC и проинкубируйте при 37 °С с умеренным встряхиванием 30—60 мин.
Таблица 8. Трансформация с использованием замороженных клеток
(методика 3)
А. Приготовление клеток
1. С помощью стерильной вольфрамовой петли отберите несколько свежих колоний диаметром 2—3 мм, выращенных на чашке со средой SOB, и диспергируйте их на встряхивателе в 1 мл среды SOB. Для получения отдельных колоний лучше всего рассеять клетки на чашке штрихом из замороженного образца или свежего столбика агара за 16—20 ч до приготовления жидкой культуры.
2. Засейте клетками колбу Эрленмейера со средой SOB или Psi‘>. Отношение объема культуры к объему колбы должно составлять от 1 : 10 до 1 : 30 (т. е. 30—100 мл на колбу объемом 1 л).
3. Инкубируйте с умеренным встряхиванием при 37 °С до тех пор, пока титр культуры не достигнет 4—7-107 жизнеспособных клеток/мл.
4. Перенесите культуру в полипропиленовые пробирки объемом 50 мл (например, пробирки Falcon 2070) и охладите во льду 10—15 мин.
5. Осадите клетки центрифугированием при 750—1000 g (2000— 3000 об/мин) в течение 12—15 мин при 4 °С. Тщательно удалите остатки жидкости, постучав перевернутой пробиркой по бумажному полотенцу. Оставшиеся капли можно удалить микропипеткой.
6. Суспендируйте клетки на встряхивателе при небольшой скорости в объеме буфера RF12>, составляющем 7з от собранного объема. Проинкубируйте клетки во льду 15 мин (DH1 или JM101) или 2 часа (НВ101).
7. Осадите клетки так, как указано на стадии 5 табл. 6.3.
8. Ресуспендируйте клетки в RF2 (>/12,5 исходного объема). Проинкубируйте во льду 15 мин.
9. Разлейте клетки в охлажденные пробирки с завинчивающимися крышками или в 1,5 мл микроцентрифужные пробирки.
10. Быстро заморозьте в смеси сухого льда с этанолом или в жидком азоте и храните при —70 °С.
Методы трансформации Е. coli
155
Продолжение
,Б. Использование замороженных клеток
1. Достаньте пробирки из холодильника и выдержите на воздухе при комнатной температуре. Как только суспензия клеток оттает, перенесите пробирки в лед. (Если клетки были заморожены в большом объеме, разлейте их в отдельные пробирки по 200 мкл.)
2. Добавьте раствор ДНК в объеме <20 мкл. Размешайте, вращая пробирку между ладонями.
3. Проинкубируйте пробирки во льду 10—60 мин.
4. Поместите пробирки в водяную баню с температурой 42 °С на 90 с (тепловой шок), затем быстро охладите до 0°С (на льду).
5. Добавьте 800 мкл среды SOC и проинкубируйте при 37 °С с умеренным встряхиванием 30—60 мин.
‘) Составы сред приведены в табл. 12.
