Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
Методы трансформации Е. coli
169
Рис. 1. Характеристические кривые трансформации клеток лигированными препаратами кДНК- Три различных препарата кДНК использовали для серии трансформаций, в которых различные количества кДНК смешивали с постоянным объемом компетентных клеток. Два препарата кДНК (светлые квадратики и кружочки) были получены на основе мРНК плаценты человека и лигированы с расщепленным EcoRl и Sail вектором pBR322 в соотношении век-тор/кДНК 25:1 (приблизительно 5-кратный молярный избыток вектора). Третий препарат (ромбики) получен на основе мРНК гладких мышц эмбрионов кур и лигирован с pUC9 в весовом отношении 20: 1. Во всех случаях указанное количество лигированной ДНК использовалось для стандартной трансформации, эффективность которой составляла 5 -108 колоний на 1 мкг сверхспи-ральной pBR322. Пунктирные линии представляют экстраполяцию, сделанную в предположении, что удвоение количества ДНК приводит к удвоению числа колоний. Масштаб обеих осей — логарифмический.
Оптимизировать колониеобразующий потенциал и плотность колоний удобно, определяя уровень насыщения для данного препарата, состоящего из вектора и кДНК. Различные препараты обладают разными уровнями насыщения даже в тех случаях, когда они содержат равные количества ДНК- Для примера на рис. 6.1 сравнивается несколько сходных препаратов кДНК. Трансформацию проводили различными количествами каждого из препаратов (от 0,25 до 100 нг суммарной
170
Глава 6
ДНК). Для каждого препарата можно подобрать такое количество ДНК, трансформация которым приводит к удовлетворительному компромиссу между суммарным колониеобразующим потенциалом (размером библиотеки) и плотностью колоний в каждой из реакций трансформации. Особо отметим, что для всех препаратов насыщение наступает при 30 нг суммарной ДНК- Обычно считают, что 50—100 нг суммарной ДНК — достаточно малое ее количество, и используют его для трансформации. Однако, как видно из рисунка, проводя 10 трансформаций 5 нг ДНК, можно получить вдесятеро больше колоний. В связи с этим для каждого препарата кДНК перед трансформацией Е. coli следует построить кривую насыщения.
8.2. «Спасение» интегрированных плазмид
«Спасение» плазмиды, интегрированной в высокомолекулярную клеточную ДНК (т. е. восстановление ее в форме автономного репликона), осуществляют в три этапа: 1) расщепление ДНК рестриктазой, не имеющей участков узнавания внутри гена (генов) устойчивости к антибиотикам и области начала репликации плазмиды; 2) лигирование при низкой концентрации ДНК для циклизации продуктов расщепления; 3) трансформация Е. coli. При этом происходит отбор небольшого числа фрагментов клеточной ДНК, несущих интегрированную плазмиду, по их способности трансформировать Е. coli.
Этот метод применялся для выделения интегрированных плазмид и прилежащей к ним ДНК из дрожжей [20], культивируемых животных клеток [21, 22] и — недавно — из трансгенных мышей. Спасение плазмид из клеток млекопитающих происходит с очень низкой эффективностью [22] в связи с тем, что в этом случае частота трансформации плохо коррелирует с количеством присутствующей плазмидной ДНК- Поэтому для того, чтобы уравновесить малую эффективность восстановления плазмиды, необходима высокая эффективность трансформации.
При восстановлении плазмид основная масса ДНК не способна к трансформации и конкурирует с плазмидной ДНК. Конкуренция со стороны неплазмидной ДНК становится ощутимой, когда ее количество достигает 100 нг. Хотя в принципе можно использовать такие суммарные концентрации ДНК, при которых конкуренция еще незаметна, оптимальным будет тот уровень ДНК, при котором необходимое для восстановления число отдельных трансформаций минимально. Этот уровень составляет 200—500 нг суммарной ДНК на одну реакцию трансформации.
Готовя клеточную ДНК к процедуре восстановления плазмиды, следует проконтролировать лигирование. Для этого
Методы трансформации Е. coli
171
аликвоты расщепленной рестриктазой и расщепленной и лигированной ДНК наносят на соседние дорожки 0,75%-ного агарозного геля, не содержащего бромида этидия. Гель окрашивают бромидом этидия после электрофореза. После лигирования должны появиться заметный сдвиг ДНК в сторону увеличения молекулярного веса и фракция ДНК, мигрирующая значительно медленнее всей массы линейной ДНК. Эта ДНК состоит из релаксированных ковалентно замкнутых кольцевых молекул и особенно полезна для оценки степени циклизации лигированной ДНК. Как правило, лигирование при восстановлении плазмиды проводят при концентрации ДНК 10— 20 мкг/мл. Затем ДНК осаждают и растворяют в концентрации 25—100 мкг/мл. Если приведенным выше методом кольцевую ДНК обнаружить не удается, то, по всей видимости, содержание ее недостаточно и препарат непригоден для эффективного восстановления плазмиды. В этом случае следует испытать другие препараты рестриктаз и ДНК-лигазы.
8.3. Хранение и амплификация плазмидных библиотек
Популяцию рекомбинантных плазмид можно ввести в Е. co-
li одним из описанных в этой главе методов, а затем поддерживать в виде набора колоний на пористой нитроцеллюлозной подложке. Такой набор можно реплицировать, а полученные копии использовать для гибридизации с нуклеиновыми кислотами или скрининга с помощью антител, а также сохранять длительное время [23, 24].
