Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
ДМСО 9 мл 90 об. %
Ацетат калия 100 мкл 1 М запасного 10 мМ
раствора (pH 7,5)
160
Глава 6
М. Раствор ДТТ
Компонент
Количество в литре
Продолжение
Конечная коицевтрацвя
.ДТТ 3,3 г 2,2 М
Вода 7 мл
Ацетат калия 100 мкл I М запасного 20 М
раствора (pH 7,5)
Приготовление: Объедините компоненты. Добавьте растворитель до конечного объема 10 мл. Водный раствор ДТТ простерилизуйте фильтрованием через мембрану с порами 0,22 мкм при помощи шприца на 10 мл. Если раствор ацетата калия стерилен, раствор ДиД стерилизовать фильтрованием не нужно. При необходимости, однако, его можио профильтровать через мембрану .Miliipore Millex SR, предназначенную для работы с органическими растворителями. Разлейте растворы на небольшие порции и храните замороженными. Каждую порцию можно замора живать и снова размораживать несколько раз. Вместо ацетата калия в растворах можно применять 10 мМ. MES, .pH 6,2.
О НАСоСЬ — трихлорид гексаминокобальта(Ш).
жизнеспособностью. Штамм-хозяин для рекомбинантных плазмид Е. coli х 1776, сконструированный Кертиссом с соавт. [19], характеризуется высокой чувствительностью к детергентам и желчным солям и, кроме того, обладает специфическими аук-сотрофными потребностями. Приведенная в табл. 9 методика лозволяет трансформировать у\77Ь с эффективностью 1—2-10® трансформантов/мкг pBR322, при этом 10—12% клеток в препарате компетентны для трансформации. Данная методика приводится здесь по нескольким причинам. Во-первых, штамм % 1776 по-прежнему используется при проведении некоторых экспериментов, например для клонирования генов токсинов. Во-вторых, клеточная оболочка % 1776
отличается от оболочки других штаммов. Возможно, что другие штаммы Е. coli, оболочка которых изменена сходным образом, могут также эффективно трансформироваться этим методом. Вот почему, если какой-либо штамм плохо трансформируется приведенными выше методами, следует испытать методику трансформации % 1776.
Описанная здесь методика сходна со стандартной методикой трансформации и в действительности предшествовала ей [15]. Основная ее особенность — применение стадии быстрого замораживания и оттаивания клеток, суспендированных в буфере для трансформации (табл. 10). Эта стадия эффективна только для 5(1776, что связано, ло-видимому, с особенностями строения оболочки этих клеток.
Методы трансформации Е. coli
161
Клетки %1776 весьма чувствительны к детергентам, поэтому предназначенную для трансформации посуду нельзя мыть с их использованием. Процедуру трансформации лучше всего проводить в пластиковых пробирках однократного применения. Штамм %1776 быстро гибнет на чашках и в столбиках агара, поэтому хранить его следует в замороженном виде. Для выращивания %1776 наилучшей оказалась среда ХЬ (см. табл. 12). Во всех случаях для выделения плазмидной ДНК и для приготовления компетентных клеток нужно пользоваться именно этой средой и проводить инкубацию при интенсивном встряхивании. Замороженные препараты компетентных клеток ^ 1776 можно хранить при —70 °С. Для этого после стадии быстрого замораживания клетки не оттаивают, а сохраняют при —70 °С. Перед использованием их размораживают и продолжают трансформацию далее по методике. В этом случае, естественно, ДНК добавляют после стадии замораживания — оттаивания.
5. Реактивы
Для приготовления компетентных клеток Е. coli используются химически чистые (reagent grade) или особо чистые химикаты. Если частота трансформации оказывается неудовлетворительной, то компоненты следует заменять поодиночке, что-
Таблица 11. Некоторые фирмы — изготовители реагентов1
Вещество Изготовитель N° по ката
логу
КС1 Alpha, Danvers, Mass, 87626
Fluka, Hauppauge, NY 60130
Aldrich, Milwaukee, WI 20,409-9
МпС!2-4Н20 MCB, Cincinnati, OH МХ0185
Aldrich 20,373-4
СаСЬ-2Н20 Fisher С79
HACoClj Alpha 23144
Aldrich 20,309-2
MES Research Organics, Cleveland, OH 0113М
Sigma, St, Louis, MO М8250
ДМСО (DMSO) Fluka 41640
Mallinkrodt 5507
