Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Гловер Д. -> "Клонирование ДНК. Методы" -> 68

Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.

Гловер Д. Клонирование ДНК. Методы — М.: Мир, 1988. — 538 c.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка): klonirovadnkdnkmetodi1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 62 63 64 65 66 67 < 68 > 69 70 71 72 73 74 .. 253 >> Следующая

2) Срставы RF1 и RF2 приведены в табл. 10.
лизирующего агента применен глицерин. Первый метод — вариант стандартной методики трансформации с использованием СаСЬ. Этот метод самый простой, но в большинстве случаев наименее эффективный. Некоторые штаммы, однако (например, штамм МС1061), трансформируются им лучше, чем методами с использованием более сложных буферов.
Второй метод представляет собой модификацию стандартной трансформации, которая дает возможность сохранять компетентные клетки в замороженном виде. Для этого б буфер добавлен глицерин, а 2[М-морфолино] -этансульфоновая кислота {MES) заменена ацетатом калия. Как MES, так и ДТТ мешают при подготовке и использовании замороженных компетентных клеток. Оптимальная плотность клеток, которые предстоит заморозить, как правило, несколько выше, чем клеток, непосредственно используемых для трансформации. Плотность DH1, например, должна быть 6—9-107 жизнеспособных клеток/мл, а не 5—7-107, как предусмотрено стандартной методикой.
Третья методика (табл. 8) разработана Симанисом (личное сообщение). Компетентные клетки, приготовленные по этой методике, обеспечивают эффективность трансформации такую же, как приготовленные по методике из табл. 7. Преимущество методики Симаниса в том, что она не требует ДМСО и позволяет отказаться от этого реактива, если есть сомнения в его качестве. Для некоторых штаммов такой метод может подойти лучше, чем предыдущие.
4.5. Трансформация %1776
Описанный здесь метод разработан в то время, когда практически во всех экспериментах с рекомбинантной ДНК в качестве бактерии-хозяина использовали штаммы с пониженной
156
Глава 6
Таблица 9. Методика трансформации "/1776
1. С помощью стерильной вольфрамовой петли отберите несколько коло* ний диаметром 2—3 мм, выращенных на чашке со средой ХЬ!). Осторожно диспергируйте их на встряхивателе в 1 мл среды ХЬ.
2. Засейте 25—100 мл среды ХЬ в колбе объемом 300 мл из расчета: 1 колония на 10 мл культуральной среды. На одну реакцию трансформации требуется 5 мл культуры.
3. Инкубируйте при 37 °С с интенсивным встряхиванием до тех пор, пока титр культуры не достигнет 5—7-107 жизнеспособных клеток/мл2'. Если клетки растут хорошо, удвоение плотности происходит за 38—45 мин.
4. Перенесите культуру в полипропиленовые центрифужные пробирки объемом 50 мл (Falcon 2070 или эквивалентные) и охладите 10—15 мин на льду.
5. Осадите клетки центрифугированием в течение 12—15 мин при 750—1000 g (2000—3000 об/мин) и 4°С.
6. Слейте надосадок и удалите остатки жидкости, постучав перевернутой пробиркой по стопке бумажных полотенец.
7. Суспендируйте клетки в буфере XFB ('/з исходного объема культуры). Диспергируйте осадок клеток либо на встряхивателе при малой скорости, либо вращая пробирку между ладонями. Проинкубируйте 5—10 мин на льду.
8. Осадите клетки так же, как на стадиях 5 и 6.
9. Ресуспендируйте клетки в XFB (7гб исходного объема культуры). При этом каждые 5 мл культуры концентрируются до 200 мкл, т. е. до объема, необходимого для одной реакции трансформации. Проинкубируйте на льду 10—15 мин.
10. На каждые 200 мкл клеток добавьте 7 мкл ДМСО, внося его в центр суспензии и быстро размешивая. Проинкубируйте клетки на льду 5—25 мин, время от времени перемешивая3*.
11. Разлейте клетки по 200 мкл й полипропиленовые пробирки 12-75 мм (Falcon 2063 или эквивалентные).
12. Добавьте ДНК в объеме 1—10 мкл. Проинкубируйте на льду 10—30 мин.
13. Поместите пробирки на 100 с в баню с температурой —70 °С. Суспензия должна замерзнуть. Используйте для бани смесь сухого льда с изопропанолом. Выньте пробирки из охлаждающей смеси и выдержите при комнатной температуре. Как только суспензия растает, перенесите пробирки на лед4>.
14. Проинкубируйте 5—10 мин.
15. Поместите пробирки на 60 с в водяную баню с температурой 42 °С (тепловой шок). Если используются пробирки другого размера и из другого материала, оптимальное время теплового шока следует подобрать экспериментально. Поместите пробирки в лед на 2 мин.
16. Добавьте 80 мкл среды ХЬ и проинкубируйте 1 час при 37 °С без встряхивания. Рассейте на чашки со средой ХЬ, содержащей необходимые для селекции плазмид компоненты.
3) Состав среды ХЬ приведен в табл. 12.
2) Это соответствует ОД55о==0,2.
3) В этой методике конечная концентрация ДМСО составляет 3,5% (по объему). В отличие от методики, приведенной в табл. 6.3, ДМСО добавляется один раз, а ДТТ не используется.
4) Компетентные клетки %\776 можно хранить длительное время при —70 °С. Для этого, не добавляя ДНК (пропустите стадию 12), заморозьте клетки и поместите в холодильник на —70 °С. После того как клетки оттают и будут помещены в лед, добавьте ДНК.
Таблица 10. Приготовление буферов для трансформации
А. Стандартный буфер для трансформации (TFB) Конечная концентрация
Компонент Количество в литре
Предыдущая << 1 .. 62 63 64 65 66 67 < 68 > 69 70 71 72 73 74 .. 253 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed