Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
12*
180
Глава 7
Таблица 2. Выделение двухцепочечной ДНК
В этой таблице приведена методика, использованная авторами для получения фрагмента длиной 39 п. н. из ДНК R78Bo.
1. Обработайте 10 мкг двухцепочечной ДНК R78Bo Pstl и Hinll.
2. Нанесите продукты реакции на 15%-ный полиакриламидный гель {толщина 1 мм, ширина 20 см, длина 20 см).
3. Проведите электрофорез 3 ч при 150 В и 50 мА.
4. Окрасьте гель 15 мин в растворе этидиумбромида (5 мкг/мл).
5. Вырежьте зону, содержащую фрагмент ДНК длиной 39 п. н., и элюируйте ДНК 5 ч при 37 °С, добавив 5 мл буфера для экстракции').
6. Разбавьте элюат в 4 раза водой и нанесите на колонку с ДЭАЭ-цел-люлозой (DE52) объемом 0,2 мл.
7. Элюируйте ДНК 0,5 мл 1,5М ацетата аммония (pH 10,0) в силикониро-ванную полиалломерную пробирку для ротора SW60.
Примечание: тРНК-носитель добавлять не следует.
8. Добавьте 1 мл охлажденного этанола.
9. Отцентрифугируйте в роторе SW60 15 мин при 40 000 об/мин.
10. Удалите надосадок и высушите осадок в вакуумной центрифуге-концентраторе. Растворите в 10 мкл воды.
') Буфер для экстракции содержит 0,5 М ацетата аммония, 15 мМ ацетата магния; 0,5 MiM ЭДТА; 10% (вес/объем) SDS.
выбранной точкой и З'-концом затравки (позиция 23), не позволяет прямо осуществить эту замену. В связи с этим мы инкубировали комплекс матрицы с затравкой с фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I Е. coli и смесью dATP, dTTP и dCTP для того, чтобы, подстроив шесть оснований к затравке, скопировать остатки G27 и G29. Затем фермент инактивировали прогревом при 75СС в течение 20 мин и невключенные нуклеотиды удаляли гель-фильтрацией. З'-ОН конец полученного после этой обработки фрагмента-затравки был комплементарен нуклеотиду G29. Теперь для получения замены G31—»-С31 было достаточно добавить обратную транскриптазу и dGTP, при этом происходило правильное включение остатка G в положение 30 и неправильное—-в положение 31. После 5 мин инкубации внесли недостающие дезоксинуклеотиды и синтез ДНК был продолжен еще в течение 30 мин. Подробная методика синтеза in vitro приведена в табл. 3. Продуктом этой реакции трансформировали Е. coli по методике, приведенной в табл. 4.
Таблица 3. Мутагенез
А. Отжиг
1. Приготовьте смесь для отжига из:
4 мкл затравки (подготовку фрагмента см. в табл. 2),
4 мкл одноцепочечной кольцевой ДНК (150 мкг/мл; в данном случае—ДНК R78B),
1 мкл буфера Hin (ЮХконцентрат1)),
1 мкл воды.
2. Введите эту смесь в силиконированный капилляр и запаяйте.
Генетические маркеры для селекции индуцированных мутаций
181
Продолжение
3. Прокипятите 3 мин на водяной бане. Медленно охладите при комнатной температуре.
Б. Элонгация затравки
4. Проинкубируйте 5 мкл отожженной смеси 15 мин при комнатной температуре в буфере Hin, содержащем dCTP, dTTP и dATP в концентрации 50 мМ с 0,5 ед. ДНК-полимеразы (фрагмент Кленова) (конечный объем 20 мкл).
5. Прогрейте 20 мин при 75 °С.
6. Приготовьте из шприца (объем 1 мл) с иглой колонку и заполните ее
0,8 мл сефадекса Q50. Присоедините колонку к микроцентрифужной пробирке, проткнув ее крышку иглой. Для удаления избытка воды отцентрифугируйте 5 мин при 1500 об/мин.
7. Нанесите на колонку 55 мкл реакционной смеси и присоедините к новой пробирке.
8. Отцентрифугируйте 5 мин при 1500 об/мин.
В. Введение некомплементарного нуклеотида
9. Приготовьте следующую смесь:
5 мкл отожженного комплекса матрица-затравка,
5 мкл 5 мМ dGTP,
5 мкл буфера для обратной транскриптазы (10Х)2),
35 мкл воды,
0,4 мкл обратной транскриптазы (12 ед/мкл).
10. Проинкубируйте 1 ч при 37 °С.
11. Добавьте 5 мкл 5 мМ смеси dATP, dCTP, dGTP, dTTP. Проинкубируйте 1 ч при 37°С.
12. Удалите невключенные нуклеотиды при помощи гель-фильтрации (см. стадии 6—8).
‘) Буфер Hin (ЮХконцентрат) содержит 0,5 М NaCl; 66 мМ MgCl2; 66 мМ трис-НС1 pH 8,0,- 66 мМ Р-меркаптоэтаиол.
2) Буфер для обратной транскриптазы (ЮХконцентрат) содержит 0,4 М трис-НС1 pH 8,0; 0,4 М MgCI2; 10 мМ дитиотрейтол.
Таблица 4. Трансформация
1. К 200 мкл компетентных клеток1) штамма 71/182> или JM1053) добавьте 20 мкл реакционной смеси после обратной транскрипции. Проинкубируйте во льду 1 ч.
2. Внесите 50 мкл свежей насыщенной культуры 71/18 или JM105; 25 мкл изопропил-р-Э-тиогалактопиранозида (IPTG) (20 мг/мл) и 25 мкл 5-бро-мо-4-хлоро-3-индолил-^-0-галактозида (BCIG) (20 мг/мл).
3. К трансформационной смеси добавьте 3 мл расплавленного и хранившегося при 42 °С верхнего агара, перемешайте и вылейте на чашку с BBL4>.
5. Инкубируйте в течение ночи при 37 °С.
’) Для получения компетентных клеток используют 40 мл экспоненциально растущей культуры, выращенной в L-бульоне. При ОПбм=0,2—0,4 клетки собирают центрифугированием в настольной центрифуге при 3000 об/мин. Осадок осторожно суспендируют в 20 мл охлажденного во льду 0,1 М CaQl2 н инкубируют 20 мин при 0°С.'После повторного центрифугирования и суспендирования в 0,4 мл 0,1 М СаС12 компетентные клетки можно использовать для трансформации сразу или сохранять иа льду в течение нескольких дней. Подробно приготовление компетентных клеток обсуждается в главе 6.
