Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
2) Генотип Е. coli 71/18 tS\lac-proW llaclatacZMAl5proAB]supE.
8) Генотип Е. coli JM105A [lac-pro]thi strpA endA s6cB15 F'[lacl4lacZAMl5proAB+]
4) Среда BBL содержит: 10 г бакто-триптона; 5 г NaCl и 10 г бакто-агара на литр. Концентрация верхнего агара 0,7% вместо 1%.
182
Глава 7
Из препаратов двух фагов, образовавших синие бляшки, была выделена ДНК, анализ последовательности которой показал присутствие ожидавшейся мутации.
1.3. Эффективность мутагенеза
Общая эффективность приведенных выше реакций такова, что лишь несколько процентов полученных при трансформации клонов содержат мутацию. Для идентификации интересующих исследователя мутантов, таким образом, требуется дополнительная работа. Благодаря описанной в этой главе методике любая мутация оказывается сцепленной с легкооб-наруживаемым маркером. В этом случае получаемые после трансформации мутантные клоны легко идентифицировать по фенотипу, обусловленному сцепленным маркером.
Частота появления мутаций зависит только от эффективности мутагенеза и системы, репарирующей неспаренные основания Е. coli. Влияние этой активности мы постарались уменьшить используя недометилированную матрицу [2, 15]. По нашим данным, эффективность включения обратной транскрип-тазой некомплементарного нуклеотида при описанных выше условиях мало отличается от 100%, так как около 85% выявленных по сцепленному с затравкой генетическому маркеру бляшек содержат мутации.
1.4. Универсальный селективный маркер
Фенотип, определяемый рамкой считывания, оказался очень полезным для идентификации индуцированных мутаций в относительно коротких последовательностях ДНК- Для фрагментов ДНК большей длины этот метод непригоден из-за присутствия в последовательностях-мишенях nonsense-кодонов. Более общий подход основан на применении «подвижного» селективного маркера, например кодирующего тРНК‘уг supF-фрагмента ДНК Е. coli длиной 203 п.н. [8]. Происходит мутагенез следующим образом. Ген-мишень клонируют в одноцепочечном векторе. Затем двухцепочечную плазмидную ДНК расщепляют рестриктазой, так чтобы на одну молекулу приходился единственный разрыв. Эту линеаризованную случайным образом ДНК лигируют с очищенной ДНК тРНК*уг supY. После трансформации и отбора рекомбинантов, несущих ген-супрессор, получают семейство рекомбинантных плазмид, содержащих вставку тРНК‘уг в различных сайтах последовательности, в которую планируется ввести мутации [3]. Любую из этих плазмид можно использовать в качестве матрицы для реакции мутагенеза in vitro. Затравкой служит фрагмент ДНК, полученный из немодифицированного гена и выбранный так,
Генетические маркеры для селекции индуцированных мутаций
183
чтобы он в каждом случае при отжиге захватывал области, прилежащие к вставке тРНК‘уг. Замены оснований вводят с помощью обратной транскриптазы, как описано выше. Мутанты можно отбирать по отсутствию swpF-активности в бактерии-хозяине, несущей подходящие селективные маркеры с amber-мутациями. Отобранные рекомбинанты будут нести нужную мутацию, но не будут содержать ДНК TPHKtyr supF.
1.5. Другие методы направленного мутагенеза
Для индукции замен оснований разработаны и другие методы. Нередко используется специфичность мутагенного действия бисульфита натрия по отношению к одноцепочечной ДНК [9—12]. Этот метод, однако, характеризуется двумя крупными недостатками: во-первых, с его помощью можно индуцировать только транзиции, а, во-вторых, реакцию трудно проконтролировать так, чтобы получить единичные точковые мутации.
Известен также мутагенез, основанный на включении in vitro аналогов оснований, способных к неправильному спариванию [13]. В этом случае, как и при мутагенезе, индуцированном бисульфитом, можно получить замены оснований только типа транзиций.
Шортл с соавт. применили метод, основанный на включении неправильного нуклеотида в ходе синтеза ДНК in vitro полимеразой Е. coli и использующий тот факт, что З'-экзонуклеаз-ная активность фермента Кленова не реализуется в отношении а-тионуклеотидов [14]. Этот метод в принципе сходен с методом направленного включения некомплементарных нуклеотидов с помощью обратной транскриптазы, описанным в этой главе и впервые использованным в работе [5]. Преимущество последнего метода, однако, состоит в использовании общедоступных реактивов.
2. Общий метод обмена аллельными последовательностями между двумя репликонами
Конечная цель экспериментов по мутагенезу—изучение фенотипа клеток, несущих в правильном генетическом контексте измененную последовательность ДНК- Большая часть методов мутагенеза, включая и описанные в разделе 1, однако, эффективна в отношении коротких фрагментов ДНК, клонированных в соответствующих векторах. Реконструкция геномных последовательностей, необходимая для изучения влияния мутации на функцию интересующего гена, несложна в том случае, когда имеются подходящие сайты рестрикции. Если такие сайты в интересующей нас последовательности встречаются не слишком часто и к тому же располагаются удобным обра-
