Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Н.4.2. Иммунофиксация
Альпер и Джонсон предложили метод, позволяющий с минимальной диффузией проводить преципитацию электрофоретиче-ски разделенных белков [27]. После завершения электрофореза в агарозном геле на его поверхность равномерно наносят соответствующую иммунную сыворотку, и гель, установленный в строго горизонтальное положение, инкубируют во влажной атмосфере в течение 2 ч. Затем гель покрывают тонким листом влажной фильтровальной бумаги, на который сверху кладут три листа толстой бумаги и стеклянную пластинку с грузом 2— 3 кг. Через 10 мин бумагу снимают с геля, промывают его в течение 6 ч солевым раствором, споласкивают дистиллированной водой, высушивают и окрашивают. Такая методика позволяет улучшить разделение веществ, идентичных (или сходных) в антигенном отношении, но слегка различающихся по подвижности. В основном она применяется для исследования генетического полиморфизма некоторых белков (см. разд. IIJ.6).
Этот же принцип Альпер и Джонсон использовали для иммунофиксации белков после электрофореза в крахмальном геле [27]. При этом они увеличивали время инкубации с антителами до 2 ч и затем тщательно отмывали гели в солевом растворе и воде. Гель окрашивали так же, как при обычном электрофорезе в крахмальном геле.
Фельгенхауэр [370] проводил иммунофиксацию белков после микроэлектрофореза в полиакриламидном геле. Гель помещали в небольшие сосудики, содержавшие 50—60 мкл антисыворотки. Преципитация происходила при 4°С в процессе встряхивания сосудиков. Преципитаты окрашивали после удаления непрореагировавшего белка путем промывания гелей. Крейг и Вайхер [716] предложили аналогичную методику для столбиков геля обычных размеров. Коттон и Мильштейн [249] разде-. ляли белки методом изоэлектрофокусирования на пластинах полиакриламидного геля. Затем электрофореграммы покрывали полосками фильтровальной бумаги (ватман № 3 ММ), пропитанными антисывороткой в соответствующем разведении. Гель вместе с полосками фильтровальной бумаги инкубировали в течение 24 ч при 37 °С во влажной атмосфере. После интенсивного промывания гель окрашивали. При разделении радиоактивных антигенов высушенные гели подвергали радиоавтографии.
11,4.3. Электросинерез (встречный электрофорез, электроиммуноосмофорез)
Этот метод, впервые предложенный Бассардом [186], в настоящее время широко используется в лабораторной практике. Он позволяет обнаруживать реакцию преципитации между раство-
римыми антигенами и антителами. Реагенты помещают в отдельные углубления в агаровом или агарозном геле, содержащем соответствующий буфер. Их миграция в геле навстречу друг другу осуществляется не в результате диффузии, а под действием электрического поля. В связи с этим метод электро-синереза применяется только в тех случаях, когда при определенных условиях антиген и антитело движутся в противоположных направлениях или когда скорости их миграции в одном направлении сильно различаются. Согласно первоначальному методу [186], в углубления вносили реагенты, смешанные с подогретым агаровым золем, однако теперь многие авторы не используют агар для этой цели.
Большинство преципитирующих антител относится к классу иммуноглобулинов G (IgG), обладающих лишь очень слабым отрицательным зарядом при pH 8—9. Поэтому электроосмоти-ческий поток смещает IgG к катоду. Электроэндосмос заметно уменьшается при замене агара агарозой. Путем подбора определенных соотношений агара и агарозы можно регулировать скорость эндосмоса, создавая тем самым оптимальные условия для электросинереза. Очевидно, что антитела следует помещать ближе к аноду, а антиген — ближе к катоду. Если расположить рядом несколько лунок с антигенами, то последние можно сравнивать между собой подобно тому, как это делается в методе двойной иммунодиффузии [186]. Видимые линии преципитации образуются в течение 1—2 ч. Избыток реагентов удаляют, продолжая электрофорез после образования преципитатов. При этом нет надобности отмывать гель перед окрашиванием, что позволяет в течение 3—4 ч получить полную картину окрашенных полос преципитации.
На практике электросинерез наиболее часто используют в клинической диагностике для обнаружения и идентификации некоторых антигенов и антител. Многие авторы сообщали о выявлении с помощью этого метода В-антигена гепатита (австралийский антиген). В недавно опубликованном техническом отчете Всемирной организации здравоохранения («Вирусные гепатиты», 1975) отмечается, что электросинерез (называемый также встречным иммуноэлектрофорезом) представляет собой высокоспецифический, быстрый, простой и сравнительно дешевый метод обнаружения вируса В гепатита. По чувствительности этот метод в 2—10 раз превосходит иммунодиффузию, однако существуют и другие, даже более чувствительные (хотя и менее специфические) методы. При определении антител, а не антигенов чувствительность метода снижается (Отчет Всемирной организации здравоохранения, методический раздел, а также [684]), Электросинерез, подобно иммуноэлектрофорезу, можно проводить на пленках из ацетата целлюлозы [1338].
