Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
11*4.1. Иммуноэлектрофорез в агаровых или агарозных гелях
В своей классической форме иммуноэлектрофорез представляет сочетание электрофореза в агаровом (или агарозном) геле с последующей двойной иммунодиффузией в той же среде. При двухмерной 'двойной иммунодиффузии антиген и антитело, помещенные в круглые или прямоугольные углубления в геле, мигрируют навстречу друг другу, в результате чего «в «нейтральной» зоне среды, где они встречаются, образуются линии преципитации (рис. 82). Положение полос преципитации зависит от коэффициента диффузии антигена (скорость диффузии антитела можно рассматривать как постоянную) и концентрации антигена относительно антитела. Существует определенный интервал концентраций антигена и антитела, в котором их соотношение является оптимальным для образования преципитата. При двойной иммунодиффузии в этом интервале относительных концентраций (называемом зоной эквивалентности) получаются четкие линии преципитации.
Сочетание электрофореза с двойной иммунодиффузией впервые описали в 1953 г. Грабар и Уильямс [460]. С тех пор было опубликовано большое число подробных обзоров, посвященных иммуноэлектрофорезу [80, 237, 261, 459, 952]. Исходный метод [460] обычно называют макрометодом (рис. 82), так как в нем применяют относительно большую стеклянную пластинку (13Х Х18 см), покрытую слоем геля толщиной 2—4 мм. В геле вырезают поперечную канавку и заполняют ее образцом, смешанным с расплавленной при 45 °С агарозой. После завершения электрофореза в геле вырезают продольные канавки (параллельные направлению миграции) и заполняют их раствором преципитирующих антител, специфических по отношению к
Рис. 82, А. Двухмерная двойная иммунодиффузия из прямоугольных канавок. / — канавка для антигена; 2 — канавка для антител. Б. Иммуноэлектрофорез. Л 3—5 — электрофоретически разделенные компоненты смеси антигенов; 2 — прямоугольная канавка для смеси антигенов (стартовая зона электрофореза); 6 — канавка для антител (иммунной сыворотки).
анализируемым антигенам. Затем пластинку помещают в горизонтальном положении во влажную камеру и выдерживают при постоянной температуре до тех пор, пока в результате диффузии не образуются линии преципитации. Описан ряд модификаций этого макрометода (см., например, [914, 1362]).
В 1955 г. Шейдеггер |[ 1126] впервые предложил микровариант иммуноэлектрофореза. Благодаря этому простому, быстрому и сравнительно дешевому методу иммуноэлектрофорез нашел широкое применение в повседневной практике. Для формирования геля используют предметные стекла (25X75 мм). Антигены, подвергаемые электрофорезу, помещают в небольшие лунки, а антитела — в продольные канавки. Следующую за электрофорезом иммунодиффузию проводят таким же способом, как и в макрометоде. Количество вносимой в канавку антисыворотки составляет 50—70 мкл.
При обычном иммуноэлектрофорезе иммунодиффузию осуществляют так, как если бы это была двойная иммунодиффузия из расположенных глом канавок или из круг-
электрофорезе зоны не имеют четко очерченной формы, и вещества в них распределены неравномерно. Поэтому линии преципитации на иммуноэлектрофореграмме представляют собой более или менее удлиненные симметричные или асимметричные дуги. Удлинение дуг наблюдается, в частности, в тех случаях, когда в анализируемом образце содержатся вещества, обладающие одинаковой антигенной активностью, но разной электрофоретической подвижностью (наиболее известным примером подобных антигенов являются нормальные иммуноглобулины). Если антиген удерживается гелем (как, например, в случае микроглобулинов или ЛНП), то образуются линии преципитации неправильной формы. Иммуноэлектрофорез имеет более низкую чувствительность, чем двойная иммунодиффузия, поскольку в процессе электрофореза происходит разбавление антигенов вследствие расширения разделенных зон.
Результаты иммуноэлектрофореза, очевидно, зависят от факторов, действующих как во время электрофореза, так и на этапе иммунодиффузии. Повышение разрешающей способности электрофореза (см., например, описанный в гл. 1.9 микроэлектрофорез в агаровом геле по Вейме {1417]) приводит к улучшению разделения полос преципитации. На иммунодиффузию влияют специфичность, титр и сродство используемой антисыворотки, а также концентрация антигенов и геометрическое расположение в геле лунок для антигенов и канавок для антител.
Одинаковые по размеру и форме углубления для антигенов и антител можно вырезать с помощью специальных устройств, таких, как набор штампов системы LKB-Gelman, предназначен-
лых лунок и канавок
Однако разделенные при
I
I
I.
Рис. 83. А. Приспособление для вырезания канавок при иммуноэлектрофорезе (фирма LKB-Gelman). Слева — вид приспособления снизу: 1 — рамка; 2 —
штамп; 3 — прорези, в которые вставляют штампы для вырезания круглых лунок; 4 — лезвия для вырезания продольных канавок; 5 —зажимы для фиксации штампа в рамке в нужном положении. Справа — то же приспособление в собранном виде, установленное над пластинками. Б. Вырезание продольных канавок с помощью трафарета и режущего колесика (фирма Sevac). 1 —пластинка, на которой проводят электрофорез; 2—трафарет из органического стекла; 3 — режущее колесико с ручкой.
