Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
ный для микроиммуноэлектрофореза на предметных стеклах (рис. 83,А). Значительно дешевле трафареты из органического стекла. В этом случае лунки вырезают цилиндрическими штампами, а канавки — режущими колесиками, подобными тем, которые применяются в системе Sevac (Прага) (рис. 83,Б). Гель из канавок для антител рекомендуется удалять только после завершения электрофореза, чтобы зоны не получились искривленными. При использовании трафарета и режущего колесика вы-
резание канавки для антител также можно отложить до окончания электрофореза. Кроме того, эти приспособления позволяют вырезать канавки любой нужной длины. Более короткие канавки удобны с двух точек зрения: они дают возможность экономить иммунную сыворотку и проводить сравнение антигенных свойств электрофоретически разделенных веществ [551].
После завершения иммунодиффузии иммуноэлектрофорег-рамму можно сразу же сфотографировать без всякой обработки геля, причем лучше в рассеянном свете (при темнопольном освещении [952]). Кроме того, линии преципитации можно окрасить каким-либо белковым красителем. Перед окрашиванием непрореагировавшие белки необходимо отмыть солевым раствором. Для этого пластины геля вымачивают в течение 24—48 ч в солевом растворе, который несколько раз меняют. В последний раз гель промывают дистиллированной водой. Во время промывания слой геля может отделиться от стеклянной пластинки. Чтобы этого не произошло, стеклянную пластинку перед нанесением на нее горячего агарового золя следует покрыть тонкой пленкой агара (на пластинку наливают разбавленный золь агара и дают ему высохнуть). После промывания гель накрывают полоской влажной фильтровальной бумаги, размеры которой на несколько сантиметров должны превышать размеры геля. Гель вместе с бумагой высушивают под вентилятором, а затем отделяют бумагу от высушенного слоя агара. Линии преципитации можно окрашивать практически любым красителем, применяемым для окрашивания белков после электрофореза в агаровом или агарозном гелях.
Как уже отмечалось, картина преципитации, получаемая при иммуноэлектрофорезе, сильно зависит от свойств иммунной сыворотки. Для каждого компонента смеси антигенов существует определенный диапазон концентраций, в котором получаются хорошо сформированные четкие линии преципитации (зона эквивалентности). В многокомпонентных смесях концентрация отдельных антигенов может различаться в широких пределах. Концентрация (титр) антител в применяемой иммунной сыворотке также может варьировать в значительной степени. Таким образом, вполне возможна ситуация, при которой зоны эквивалентности для разных компонентов смеси не будут перекрываться. В связи с этим иммуноэлектрофорез многокомпонентных смесей рекомендуется проводить при нескольких относительных концентрациях антиген-антитело, так как при использовании только одной такой концентрации можно не обнаружить какие-то компоненты. Предложен, в частности, метод иммуноэлектрофореза с применением последовательных разведений сыворотки человека [618, 619]. Этот метод «иммуноэлектрофоретического титрования» полезен для полуколичественного определения от-
Рис. 84. Пример иммуноэлектрофоретического титрования: серийные разведения нормальной сыворотки человека и поликлональной сыворотки, взятой у больных гиперглобулинемией. [С любезного разрешения д-ра J. Jako (Будапешт).]
дельных белков сыворотки и для обнаружения моноклональных иммуноглобулинов (рис. 84).
Кроме метода титрования существуют и другие способы количественного определения антигенов путем иммуноэлектрофореза. Был описан метод, основанный на принципе простой иммунодиффузии if80, 81, 1962], при которой углубления для антигенов и антител примыкают непосредственно друг к другу. Антиген, находящийся в одной части геля, диффундирует в другую, содержащую антитела, и на границе этих двух частей образуется линия преципитации. Первичная зона преципитации растворяется затем в избытке антигена, продолжающего поступать благодаря диффузии в ту часть геля, где находятся антитела. Растворимые комплексы антиген-антитело вновь преципи-тируют при реакции с антителами в прилежащей зоне геля. Описанная последовательность событий — преципитация, растворение и повторная преципитация — создает впечатление, что преципитат движется. Путь, пройденный передним краем преципитата за тот или иной период времени, может служить мерой для определения концентрации антигенов. При этом в качестве стандартов необходимо использовать образцы с известной концентрацией антигена. При количественном иммуноэлектрофорезе для проведения простой иммунодиффузии разделенных компонентов в геле вырезают широкую канавку, непосредственно примыкающую к лунке с антигеном (рис. 85), и заполняют
мл
7
*:
с
1
т ©
©
в
Рис. 85. А. Простая линейная иммунодиффузия в одном направлении. 1 — гель, содержащий антитела; hi—hA— расстояние, пройденное «передним краем> преципитата при повышающихся концентрациях антигена. Б. Простая двухмер* ная иммунодиффузия. 1 — участок геля, содержащего антитела; 2— участки геля, содержащие антиген в повышающихся концентрациях; h\—/ц — расстояние, между самой дальней точкой дуги преципитата и границей между двумя гелями при возрастающих концентрациях антигена. В. Количественный иммуноэлектрофорез по Бакхаушу и др. [81] и по Ухтерлони [951]. После электрофореза участок геля (У) заменяют гелем, содержащим антитела. Во время иммунодиффузии несколько раз измеряют расстояние Л, исходя из которого рассчитывают концентрацию антигена. Показано, что расстояние К также может быть использовано для определения концентрации антигена [80]. 2 — прямо* угольная канавка для антигена (стартовая зона электрофореза).
