Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
ДВУХМЕРНЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ С ИЗМЕНЕНИЕМ pH
По этому методу электрофорез в первом направлении проводят в цилиндрическом геле, заключенном в стеклянной трубке, а во втором — на пластине геля. После первого разделения гель необходимо уравновесить с буфером, используемым во втором направлении. Один способ такого уравновешивания состоит в простом вымачивании геля в буферном растворе. Однако в этом случае для достижения нужного pH требуется несколько часов, а за это время может произойти расширение зон в результате диффузии и частичное вымывание белков из геля. Другой путь изменения pH предложили Авитал и Элсон [68]. После первого разделения при щелочном pH гель подкисляли, помещая его на несколько минут в пары концентрированной соляной кислоты или в ее разбавленный раствор.
После уравновешивания цилиндрический столбик геля за-плавляют в пластину геля и проводят электрофорез во втором направлении обычным способом.
Разрешающую способность обсуждаемого метода можно повысить, используя на двух последовательных этапах электрофо-
реза гели разной концентрации. Подобные системы применя-лись, в частности, для разделения рибосомных белков [585, 586, 654]
ДИСК-ЭЛЕКТРОФОРЕЗ С ПОСЛЕДУЮЩИМ ЭЛЕКТРОФОРЕЗОМ В ДСН-ПОЛ И АКР И Л АМИД НОМ ГЕЛЕ
Настоящий метод дает превосходное разрешение, если первый этап электрофореза проводят в относительно разбавленных гелях при pH, подходящем для всех белков, присутствующих в смеси. Он не только обладает очень хорошей разрешающей способностью, но и позволяет определять молекулярные массы разделяемых компонентов, поскольку подвижность белков при миграции в гелях, содержащих ДСН, зависит лишь от размеров их молекул. Методы такого рода широко используют для разделения природных смесей белков (примеры приведены в главах, посвященных разделению определенных групп белков).
После проведения диск-электрофореза при любом выбранном значении pH гель следует уравновесить с содержащей ДСН буферной системой, применяемой во втором направлении. Простейшим способом опять же является вымачивание геля в буфере, содержащем ДСН в значительно более высокой концентрации (около 1—2%), чем в пластине геля (около 0,1%). При этом следует иметь в виду, что во время уравновешивания может происходить потеря белка и расширение зон.
Другой способ осуществления реакции между белками и ДСН после первого этапа электрофореза предложили Метц и Богорад [865, 866]. Они применили процедуру (см. подробное описание в разделе, посвященном электрофорезу рибосомных белков), в которой буфер, используемый при электрофорезе в первом направлении, играет роль концентрирующего буфера в неоднородной буферной системе, применяемой во втором направлении. Сразу же после первого этапа электрофореза гель заплавляют в пластину геля и начинают электрофорез в направлении, перпендикулярном первому. В верхний электродный буфер добавляют ДСН, который под действием электрического поля входит в гель и образует комплексы с белками, разделенными при электрофорезе в первом направлении.
Электрофорез во втором направлении можно также проводить в геле с градиентом концентрации полиакриламида в присутствии ДСН. Такая система была использована для разделения рибосомных белков [89]. Применение градиента геля во втором направлении целесообразно, по-видимому, в тех случаях, когда разделяемые белки имеют молекулярные массы, различающиеся в широких пределах.
ИЗОЭЛЕКТРОФОКУСИРОВАНИЕ С ПОСЛЕДУЮЩИМ ЭЛЕКТРОФОРЕЗОМ
Вскоре после первых сообщений об ИЭФ в геле этот метод в сочетании с электрофорезом был использован для разделения бел« ков сыворотки крови |[269, 270] и пероксидаз из сока клубней картофеля [794]. Электрофорез во втором направлении можно проводить не в полиакриламидном, а в крахмальном геле ,[1460]. Кенрик и Марголис [670] применили для разделения белков сыворотки крови сочетание ИЭФ с электрофорезом в градиенте концентрации полиакриламида. Разделение в 1-м направлении они проводили в градиенте pH 3—10, а во 2-м — в градиенте концентрации геля вогнутой формы (4,5—26% Т).
ИЗОЭЛЕКТРОФОКУСИРОВАНИЕ С ПОСЛЕДУЮЩИМ ЭЛЕКТРОФОРЕЗОМ В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ, СОДЕРЖАЩЕМ ДСН
Так как в данном случае разделение белков в первом направлении проводится в соответствии с их изоэлектрическими точками, а во втором — в соответствии с размерами молекул и так как эти параметры не зависят один от другого, комбинация двух указанных методов является одним из лучших способов получения фингерпринтов белковых смесей. Метод имеет высокую разрешающую способность и позволяет одновременно определять ИЭТ и молекулярные массы разделяемых компонентов.
Системы этого типа были использованы для разделения не-гистоновых белков хроматина [91, 790]. Точность метода составляла ±3000 дальтон для мол. массы и 0,2 ед. pH для ИЭТ.
Хорошим примером, показывающим, какое высокое разрешение может быть достигнуто при комбинации ИЭФ с электрофорезом в ДСН-полиакриламидном геле, служит разделение суммарной смеси белков Е. coli на 1100 фракций ![935]. При изоэлектрофокусировании было получено 70 зон. Если же белки фракционировали только с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с ДСН, то на электрофореграмме обнаруживали 100 зон. Таким образом, в результате комбинации этих методов в двухмерной системе можно было бы разделить около 7000 компонентов. Но эта величина превышает максимально возможное число белков Е. coli (4000), рассчитанное на основании средней мол. массы белков и числа кодонов в ДНК данного организма.
