Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Строго говоря, площадь под пиком преципитата пропорциональна количеству внесенного антигена и обратно пропорциональна концентрации антител в геле. Если допустить, что высота пика преципитата пропорциональна его площади, то можно с достаточной точностью определить количество антигена путем измерения расстояния от верхнего края лунки до вершины пика. Для получения калибровочной кривой на гель наносят ряд стандартных антигенов с известной концентрацией. Сколари и др. [1156] обнаружили, что линейная зависимость между площадью пика и количеством антигена сохраняется в более широком интервале концентраций антигена по сравнению с такой же зависимостью между концентрацией антигена и высотой пика. Точность метода зависит от того, насколько близки между собой размеры молекул и величина зарядов исследуемых и стандартных антигенов. Воспроизводимость количественных определений наиболее высока в том случае, когда образуются симметричные пики преципитации с отчетливыми внутренними и внешними границами. Стандартная ошибка может при этом составлять 2—5%, несколько превышая ошибку, которую дает простая радиальная иммунодиффузия при оптимальных условиях [807].
С помощью электрофореза в геле, содержащем антитела, можно проводить сравнительный анализ антигенов. Данный вопрос обсуждают Грабб [491] и более детально Аксельсен и его соавторы [74, 140]. Здесь мы рассмотрим один из многих возможных вариантов этого метода. Стандартный антиген помещают в прямоугольную канавку, а исследуемый образец — в круглую лунку, расположенную ближе к катоду [491]. При таком расположении можно получить картину, указывающую
Рис. 89. Сравнение антигенов методом Грабба [491]. А. Неидентичность антигенов 5 и 1. Б. Полная идентичность антигенов 5 и 2. В. Частичная идентичность антигенов 5 и 3 (антиген 5 является неполным по отношению к антигену 3), Г. Частичная идентичность антигенов 5 и 4 (антиген 4 неполон по отношению к антигену 5).
на полную или частичную антигенную идентичность, либо на отсутствие идентичности (рис. 89). Эта методика представляет собой упрощенный вариант ракетно-линейного иммуноэлектрофореза [719].
В обычных условиях (вероналовый буфер, pH 8,6, ионная сила 0,02—0,08) подвижность преципитирующих антител у большинства видов животных практически равна нулю. В действительности, конечно, это не совсем так, поскольку антитела гете-рогенны по своей электрофоретической подвижности. И тем не менее для правильного проведения электроиммуноанализа необходимо, чтобы основная масса антител оставалась неподвижной. Такое ограничение суживает пределы применимости метода, так как те антигены, которые в указанных условиях движутся к аноду не намного быстрее, чем антитела, будут давать несимметричные пики, а следовательно, данный метод непригоден для точного определения их количества.
Указанное ограничение можно устранить, если повысить анодную подвижность антигенов путем их химической модификации. Сделать это можно с помощью карбамилирования [1382], а также реакции с формальдегидом [421] или с |3-про-пиолактоном [1234].
Способ карбамилирования очень прост: к исследуемым и стандартным пробам добавляют 2 М KOCN в соотношении 1 : 1 (объем/объем). Смесь оставляют на 30 мин при 45°С, а затем охлаждают в ледяной бане, чтобы остановить реакцию, Пробы разводят до необходимого объема буфером, после чего они готовы для электроиммуноанализа.
Шуллер и Тёмпе |[П47] описали надежный метод электроиммуноанализа малых количеств медленно мигрирующих антигенов (иммуноглобулинов), основанный на добавлении в гель карбоксиметилцеллюлозы.
Если предполагается проводить электроиммуноанализ при более низком значении pH, то химической модификации должны быть подвергнуты антитела. Было проведено детальное изучение реакции карбамилирования антител [127]. Варьируя продолжительность реакции, можно легко контролировать степень карбамилирования и таким образом получать антитела, обладающие при нужном значении pH нулевой электрофоретической подвижностью. Так, например, карбамилированные антитела дают возможность проводить электроиммуноанализ иммуноглобулинов при pH 5,0 [126], когда иммуноглобулины перемещаются к катоду под действием электроосмоса. Преимущество использования модифицированных антител состоит в том, что оно позволяет избежать модификации исследуемых образцов.
11.4.5. Перекрестный иммуноэлектрофорез (перекрестный электрофорез в системе антиген — антитело)
Настоящий метод можно рассматривать как электроиммуноанализ белков, предварительно разделенных методом электрофореза (рис. 91). Исторически этот метод появился раньше, чем электроиммуноанализ, поскольку Лорелл описал его в 1965 г., тогда как электроиммуноанализ был применен им в 1966 г. [740] в качестве метода, позволяющего использовать возможности перекрестного иммуноэлектрофореза для количественных определений. Существуют два основных варианта перекрестного иммуноэлектрофореза. Первый вариант — это исходный метод, предложенный Лореллом [739]. Подробное его описание (включая ряд модификаций) было сделано Ганротом [424]. Второй вариант представляет собой модификацию первоначального метода {873]. Согласно варианту Лорелла, в канавку вносят смесь антигенов и проводят электрофорез в агарозном геле так, как это описано Иохансоном [631]. Электрофореграмму разрезают по длине и каждую полоску помещают в канавку соответствующего размера, вырезанную в геле, содержащем антитела. В модифицированном методе электрофореграмму, полученную при электрофорезе в первом направлении, целиком переносят на вторую пластинку, а свободную поверхность пластинки заливают гелем, содержащим антитела. Метод Лорелла обладает более высокой разрешающей способностью. С другой стороны, он пригоден лишь для сравнительного исследования компонентов на одной электрофореграмме, тогда как модифицированный метод
