Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
П.4.4. Электроиммуноанализ (электроиммунодиффузия, ракетный иммуноэлектрофорез)
Суть метода электроиммуноанализа заключается в том, что антигены в процессе электрофореза мигрируют в гель, содержащий антитела, в результате чего происходит реакция преципитации. В обратной постановке опыта антитела перемещаются в гель, содержащий антиген. В строгом смысле слова этот метод не является электрофоретическим. Если рассматривать электро-синерез как аналог двойной иммунодиффузии, то электроиммуноанализ можно считать аналогом простой иммунодиффузии.
Как правило, антигены мигрируют в гель, содержащий антитела. Раствор антигенов помещают в лунки, вырезанные в геле. Во время электрофореза образуются зоны преципитации, имеющие форму пиков (рис. 88). Передний край преципитата перемещается с постепенно уменьшающейся скоростью по направлению к одному из электродов до тех пор, пока мигрирующий антиген не перестает поступать в избытке.
Впервые электроиммуноанализ описали Лорелл [740], а также Мерилл и др. [862]. Позже Лорелл [741] и Вееке ([1385] опубликовали подробное описание этого метода, а Фер-брюгген дал исчерпывающий обзор соответствующей литературы (включая метод перекрестного иммуноэлектрофореза) [1336].
Электроиммуноанализ проводится следующим образом. Готовят 0,8—1,5%-ный золь агарозы в соответствующем буфере. После охлаждения золя до 45—55 °С его смешивают с антисывороткой или с выделенными антителами и формируют слой геля толщиной 1 —1,5 мм. С этой целью теплый золь агарозы выливают на стеклянную пластинку, установленную строго горизонтально, или заливают агарозу в форму, образованную двумя стеклянными пластинками и U-образной рамкой. Рамку оставляют между стеклами до завершения электрофореза, но ее можно удалить и залить освободившееся пространство агарозой. Как правило, требуется сравнительно небольшое количество антисыворотки, но оно, естественно, зависит от ее титра. Для количественного анализа наиболее удобны пики преципитации высотой 20—30 мм. Работать следует с самым большим разведением антисыворотки, при котором еще возможно образование видимого преципитата. Разведение антигена должно быть подобрано соответствующим образом. Если исследуют антигены с мол. массой более 200000, то в этом случае особенно важно разбавлять реагенты до такой степени, чтобы происходила лишь слабая преципитация, поскольку крупные комплексы таких антигенов с антителами могут забивать поры в геле, что
Рис. 88. Электроиммунный анализ восстановленного и алкилированного IgM крысы. Лунки для антигенов содержат (слева направо) 1,0; 0,75; 0,5 и
0,25 мкг стандартного белка и три параллельные пробы антигена с неизвестной концентрацией. Перед электроиммунным анализом все образцы были обработаны 1 М KOCN при 45 °С в течение 30 с. Гель содержал 1% козьей антисыворотки к IgM крысы.
приведет к образованию полос преципитации неправильной формы.
Лунки диаметром 3—4 мм вырезают в геле ближе к его катодному концу. Делают это с помощью пластмассового трафарета и металлической трубки с достаточно острыми краями. Простое приспособление такого типа описал Вееке .[1384]. Лунки должны быть расположены на расстоянии не менее 6 мм друг от друга и 1—1,5 см от краев геля (во избежание краевых эффектов). Чаще всего используют 20—80 мМ вероналовые буферы с pH 8,6. При таком значении pH средняя подвижность антител в гелях агарозы близка к нулю. Электрофорез можно проводить либо при относительно высоком напряжении (8—10 В/см) в течение 2—4 ч (быстрый ракетный электрофорез, при котором необходимо эффективное охлаждение), либо при низком напряжении (2 В/см) более длительное время (удобно проводить электрофорез в течение ночи).
При электроиммуноанализе и перекрестном иммуноэлектрофорезе используют, как правило, антитела кроликов или коз. С антителами лошади были получены неудовлетворительные результаты [73, 837], что, вероятно, объясняется более высокой подвижностью антител гипериммунной сыворотки данного вида. Петерфи и др. |[997] получили отчетливые, хорошо оформленные преципитаты путем превращения антител лошади во фрагменты F(ab')2. Это, по-видимому, обусловлено тем, что фрагменты F(ab'h обладают такой же подвижностью, как и у-глобу-
лины, тогда как антитела мигрируют вместе с ^-глобулинами. Фрагменты получают путем обработки цельной сыворотки пепсином при pH 3,6 и последующего дробного осаждения гидролизата (NH4)2S04.
После электрофореза непреципитированные белки можно удалять промыванием солевым раствором. Лорелл [741, 742] рекомендует более быстрый способ. Гель покрывают листом фильтровальной бумаги, величина которого слегка превышает размеры геля. Затем на него помещают слой толстой фильтровальной бумаги толщиной 2—3 см, а сверху кладут легкий груз (около 10 г/см2), например толстую стеклянную пластинку. Через 10—15 мин фильтровальную бумагу снимают и гель промывают в течение 15 мин солевым раствором. После многократного промывания солевым раствором гель вымачивают в течение 15 мин в дистиллированной воде, опять кладут на 10—15 мин под пресс и, наконец, сушат горячим воздухом. Сухие пластинки геля можно окрашивать обычными красителями для белков или с помощью более специфических реакций.
