Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Гааль Э. -> "Электрофорез в разделении биологических макромолекул" -> 99

Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.

Гааль Э., Медьеши Г., Верецкеи Л. Электрофорез в разделении биологических макромолекул — М.: Мир, 1982. — 448 c.
Скачать (прямая ссылка): elektroforezvrazdeleniibiologicheskih1982.djvu
Предыдущая << 1 .. 93 94 95 96 97 98 < 99 > 100 101 102 103 104 105 .. 185 >> Следующая

Описанный метод используют главным образом для одновременного количественного определения всех компонентов какой-либо гетерогенной смеси. Для этой цели нужна антисыворотка, содержащая антитела ко всем анализируемым компонентам, причем титр этих антител должен быть достаточно высоким, чтобы образовались преципитаты, поддающиеся измерению. Подобную «сбалансированную» антисыворотку трудно получить путем иммунизации. Ганрот [424] предлагает готовить антисыворотки высокого титра для нескольких антигенов, а затем смешивать их в таком соотношении, при котором обеспечивается адекватное содержание антител для каждого антигена. Очевидно, более выгодно использовать при перекрестном иммуноэлектрофорезе смесь антигенов в двух разных концентрациях {1017]. Само количественное определение заключается в измерении площадей под пиками преципитации. Его можно провести с помощью полуавтоматического электронного планиметра [873, 1386]. Другой способ состоит в том, что пластинку проецируют на лист белой бумаги, пики обводят карандашом, вырезают и взвешивают. Если методика электрофореза отличается высокой
Гель, содержащий - поливалентные антитела
Пром ежу точный гель
fель 1-го ~ направления
Г?ль, содержащий —поливалентные антитела
Промежуточный гель
Гель 1-го направления
Рис. 92. Сочетание линейного иммуноэлектрофореза [717] с перекрестным иммуноэлектрофорезом и методом промежуточного геля [1257]. А. Промежуточный гель состоит только из забуференной агарозы. Б. Гель первого направления отсутствует, промежуточный гель содержит очищенный антиген d (линейный иммуноэлектрофорез). В. Гель первого направления содержит антигены а—е, а промежуточный гель — очищенный антиген d (компонент смеси d образует пик, сливающийся с продольным преципитатом). Г. Промежуточный гель содержит моноспецифические антитеза к компоненту d. Антисыворотку подвергали истощению растворимым антигеном а, избыток которого образовал
линию преципитации.
воспроизводимостью и форма преципитатов близка к симметричной, то площадь пика можно рассчитать, умножая его высоту на ширину, измеренную на половине высоты пика [1386]. Количественное определение можно сделать более точным, если использовать «внутренний» стандарт, который в известном количестве добавляется к образцу. Такое вещество при электрофорезе в первом направлении должно мигрировать в зону, не содержащую анализируемых белков. При исследовании белков сыворотки крови в качестве «внутреннего»' стандарта служил ацетили-рованный альбумин [873]. Вееке [1382] рекомендует применять для этой цели карбамилированный трансферрин. Площадь всех остальных пиков сравнивают с площадью пика, образуемого внутренним стандартом, и результаты выражают в относительных единицах.
Идентификация отдельных антигенов в сложной смеси представляет собой довольно трудную задачу. Если имеется очищенный антиген, то его можно добавлять к анализируемой смеси, и при этом будет наблюдаться увеличение соответствующего пика преципитации. Можно, наоборот, добавлять к смеси антигенов моноспецифическую антисыворотку, что приведет к уменьшению пика соответствующего антигена. Другая возможность заключается в том:, что между гелем первого направления и гелем, содержащим полиспецифические антитела, помещают гель, содержащий один из антигенов в очищенной форме. Движущийся из промежуточной зоны антиген образует продольную линию преципитации, которая сольется с пиком преципитации идентичного антигенного компонента смеси, разделенной в первом направлении [718, 719] (рис. 92).
Кроме иммунсгхимических методов для идентификации некоторых компонентов можно ' применять специфические методы окрашивания или связывания со специфическими лигандами (например, таким образом обнаруживают в сыворотке гапто-глобины или тироксинсвязывающие белки).
МИКРОМОДИФ'ИКЛЦИКГ ПЕРЕКРЕСТНОГО И ММ УН ©ЭЛЕКТРОФОРЕЗА В АГАРОЗНОЛ1 ГЕЛЕ
Микромодификации описанного выше метода [873] были разработаны с целью экономии антисыворотки и времени, а также для того, чтобьг сделать его более пригодным для использования в повседневной практике. Эти микромодификации вполне удовлетворяют указанным требованиям и лишь немного уступают в точности исходному макроварианту. Правда, число антигенов, выявляемых и количественно определяемых микрометодом на одной пластинке, вероятно, меньше их истинного числа.
Стефан и Фрам [1235] описали метод перекрестного иммуноэлектрофореза на пластинках размером 5X5 см. При электрофорезе в первом направлении в круглые лунки, вырезанные в-геле, вносят три параллельных образца. После электрофореза гель разрезают и полоску с электрофореграммой одной из крайних проб оставляют на пластинке, а две другие полоски переносят во влажную камеру и сохраняют в качестве резерва. На освободившуюся поверхность пластинки наливают золь агарозы, содержащий антитела, и проводят электрофорез во втором направлении, перпендикулярном первому. Авторы использовали стандартную камеру для иммуноэлектрофюреза. Вееке [1385] описал аналогичный вариант данного м)етода. Электрофорез в первом направлении проводят на пластинках размером 10Х ХМ см. На каждой пластинке делают по восемь канавок (IX Х(3 мм) для образцов. После первого разделения полоски (1X5 ем) переносят на гсластикки размеров 5X5 см для элект-
Предыдущая << 1 .. 93 94 95 96 97 98 < 99 > 100 101 102 103 104 105 .. 185 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed