Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Скуде и Джеппсон [1191] в первом направлении проводили ИЭФ в полиакриламидном геле, а антитела включали в комбинированный полиакриламидно-агарозный гель (2% полиакриламида и 0,5% агарозы), вполне пригодный для иммунопреципитации. Во время электрофореза во втором направлении необходимо было накрывать гель тонкой полимерной пленкой, чтобы предотвратить сокращение объема Джонсон и др. [643] проводили электрофорез в первом направлении в комбинированном геле (5% полиакриламида и 0,8% агарозы), а во втором — в агарозном геле, содержащем антитела.
Используют также микровари-ант диск-электрофореза в полиакриламидном геле (ом. разд. 1.11.3) в сочетании с электрофорезом в геле, содержащем антитела [271,
434]. Дэймс и др. [271] применяли стеклянную камеру, которую сконструировали Маурер и Дати [843] для микроэлектрофореза на пластинках полиакриламидного геля (рис. 94). Свободное пространство камеры составляет 75X18X0.75 mim.
Дно камеры заплавляют забуференной агарозой. Сверху наслаивают агарозу, содержащую антитела, оставляя верхнюю часть камеры (15 mim) незаполненной. После за-
полиакриламидного геля.
t'uc. 94. Диск-микроэлектрофорез с последующим электрофорезом в агарозном геле, содержащем антитела [271]. Схематическое изображение! установки.
стывания агарозного геля на него помещают столбик полиакриламидного геля и заполняют камеру доверху забуференной агарозой. Технические детали этой методики приведены в обзоре Нейхоффа [915]. Электрофорез в геле с антителами проводят в закрытой камере в вертикальном положении. При этом не было обнаружено накопления жидкости или ее обратного тока iB результате эндосмоса, несмотря на то, что для его предотвращения не применяли каких-либо специальных мер. Между полиакриламидным и агарозным гелями, очевидно, обеспечивается хороший контакт. Авторы подчеркивают, что все эти приемы требуют определенного экспериментального мастерства и навыков. По другой методике [434] после джж-микроэлектро-фореза столбик полиакриламидного геля заплавляют в пластину агарозного геля и электрофорез во втором направлении проводят в горизонтальной плоскости. Используя «сбалансированную» антисыворотку (смесь оптимальных количеств разных антисывороток), авторы этой методики смогли разделить и количественно определить 21 белок в сыворотке человека.
ЭЛЕКТРОИММУНОАНАЛИЗ И ПЕРЕКРЕСТНЫЙ ИММУНОЭЛЕКТРОФОРЕЗ НА ПЛЕНКАХ ИЗ АЦЕТАТА ЦЕЛЛЮЛОЗЫ
Как уже отмечалось, ацетат целлюлозы является вполне подходящей средой для иммунопреципитации, поэтому его можно использовать также для электроиммуноанализа и в меньшей степени для перекрестного иммуноэлектрофореза. Существенное различие между ацетатом целлюлозы и агарозой состоит в том, что в первом практически отсутствует электроэндосмос. В результате при pH 8,6 большинство антител будет двигаться в электрическом поле к аноду. При анализе антигенов, подвижность которых лишь ненамного превышает подвижность антител, последние будут мигрировать в сторону, противоположную от зоны нанесения антигенов, что приведет к образованию пиков преципитации, лишенных базовой линии. Чтобы свести к минимуму подвижность антител, необходимо снизить pH буферного раствора. Электроиммуноанализ альбумина был осуществлен при pH 6,5 [717], а лактоферрина — при pH 7,4 [1125]. Белки сыворотки крови, обладающие подвижностью сн- и аг-глобули-нов, удалось успешно разделить при pH 8,6, но для разделения трансферрина и иммуноглобулинов пришлось снизить pH до 7,4.
Большинство авторов пропитывают пленки антисывороткой, погружая их в раствор антисыворотки соответствующего разведения. В одной из работ [1125] подчеркивается, что пленку следует погружать в раствор медленно, чтобы предотвратить захват ею пузырьков воздуха. Затем пленку осушают, помещая ее между листами фильтровальной бумаги, причем этот этап имеет очень важное значение, поскольку количество остающихся
на пленке антител зависит от степени осушения. При использовании целлогеля (фирменное название желатинизированного ацетата целлюлозы) пленку не погружают в раствор антисыворотки, а, предварительно промыв ее в буфере и осушив между листами фильтровальной бумаги, наносят на нее антитела с помощью специального распределительного устройства, выпускаемого той же фирмой (Chemitron, Италия). Распределительное-устройство многократно передвигают по пленке взад и вперед, до тех пор, пока в нее не впитается вся жидкость, на что будет указывать исчезновение с поверхности влажного блеска. Пиззо-лато и др. [1015] предпочитают сначала наносить образцы, а затем уже распределять антитела по пленке. Объем образца для электроиммуноанализа на ацетате целлюлозы должен составлять 0,2—0,3 мкл, а на целлогеле— 1 мкл. '
Пиззолато [1014] описал перекрестный иммуноэлектрофорез на пленках из целлогеля IM толщиной 0,3 мм в трис-глицино-вом буфере с pH 8,7. После электрофореза в первом направлении на пленку наносили с помощью специального устройства козью антисыворотку против сыворотки человека. В другой работе [871] для аналогичной процедуры использовали ацетат целлюлозы на подложке из материала, носящего фирменное название mylar. Пленку погружали одним концом в антисыворотку нужного разведения и давали фронту жидкости подняться за счет капиллярных сил на расстояние 2 см от противоположного конца. Затем пленку слегка промокали фильтровальной бумагой и другой ее край погружали в трис-вероналовый буфер с pH 8,9. Из двух описанных методик первая, по-видимо-му, более удобна, поскольку электрофорез в первом направлении можно проводить в этом случае на пленке, не содержащей антпсыворотки. В работе Пиззолато [1014] были получены более четкие базовые линии, что, возможно, объясняется особым характером подвижности козьих антител, которые были исполь^ зованы в этой работе (см. также [1336]).
