Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Иммунохимическая характеристика разделенных компонентов возможна и в том случае, если электрофорез проводят в крахмальном геле. После электрофореза крахмальный гель разрезают обычным способом на тонкие пластинки (желательно толщиной не более 0,3 мм), а пластинки — на полоски, соответствующие электрофоретически разделенным антигенам. Полоски переносят на стеклянные пластинки и заливают их теплым агаровым золем. Затем на определенном расстоянии от полоски крахмального геля и параллельно ей вырезают канавки для ан-
тисыворотки. После завершения иммунодиффузии полоски крахмального геля удаляют, образовавшуюся щель заполняют теплым агаровым золем и дают ему застыть. Непреципитировавшие белки можно удалить из геля путем промывания, после чего гель высушивают и окрашивают, как обычно.
Если полоски крахмального геля отбирают для иммунодиффузии путем сравнения с параллельной окрашенной полоской,, то следует учитывать, что гель сжимается в процессе окрашивания и обецвечивания. Для предотвращения ошибок на этом этапе Паулик [1030] рекомендует перед разрезанием блока геля на пластинки на его смежных сторонах вырезать через рдв-ные интервалы отверстия. При сопоставлении окрашенных и неокрашенных пластинок геля эти отверстия служат указателями для последующего вырезания участков геля, содержащих анализируемые антигены. Паулик провел иммунохимический анализ, выявив таким способом локализацию фракций, разделенных двухмерным электрофорезом в крахмальном геле [1030].
Для анализа антигенов, разделенных с помощью электрофореза или электрофокусирования в полиакриламидном геле, разработаны многочисленные методы иммунодиффузии. Так, для этой цели можно использовать различные варианты двойной иммунодиффузии. Цилиндрические столбики геля разрезают продольно на две половинки (см. разд. 1.15.6), а из пластин нарезают полоски, содержащие разделенные антигены. Разрезанный гель помещают на стеклянные пластинки, заливают их теплым раствором агара и дают ему застыть. Канавки для антител располагают на соответствующем расстоянии от полиакриламидного геля. Как только полиакриламидный гель покроется слоем агара толщиной 1 мм, в непосредственной близости от него сразу же вырезают канавку для антисыворотки. Если для анализа используют разрезанные вдоль столбики полиакриламидного геля, то их кладут на слой агарового геля и в нем рядом с полоской геля по обеим ее сторонам быстро вырезают канавки для антител. Преципитаты образуются под полоской полиакриламидного геля. Столбик полиакриламидного геля можно также разрезать в поперечном направлении на диски и проанализировать присутствующие в них антигены методом двойной радиальной диффузии {203, 394].
Кроме того, для анализа антигенов применяют принцип простой иммунодиффузии. Лучше всего это сделать, поместив продольно разрезанные цилиндрические столбики геля на поверхность агарового геля, содержащего антитела. Оптимальную концентрацию антител, которую следует внести в гель, определяют в предварительных опытах. Был предложен еще один интересный экспериментальный прием [802]. Полиакриламидный гель формируют в виде полого цилиндра, используя для полимери-
зации трубочку, в середину которой помещен пластмассовый стержень (из органического стекла или тефлона). Полимеризацию и электрофорез проводят, не вынимая из трубочки пластмассовой вставки. После завершения электрофореза вставку вынимают и образовавшийся канал заполняют теплым агаровым золем, содержащим антитела. Полосы преципитации выявляются в виде дисков. Картину преципитации можно наблюдать, не вынимая геля из стеклянной трубки. Цейне и др. if 1480] назвали этот метод «иммуноэлектрофорезом с сердцевиной» и применили его для анализа белков мочи.
ИММУНОЭЛЕКТРОФОРЕЗ НА АЦЕТАТЕ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ
Электрофорез на ацетате целлюлозы проводят обычным способом. Антиген наносят в виде капли или короткой полоски. Для наблюдения' за миграцией образца рекомендуется использовать краситель.
После электрофореза полоски пленки помещают во влажную камеру. Для этой цели удобно использовать плоскую пластмассовую коробку с плотно прилегающей крышкой. Пленку кладут на подложку из фильтровальной бумаги с прямоугольной прорезью так, чтобы с подложкой соприкасались только края пленки. Подложки можно изготавливать, например, из нескольких слоев фильтровальной бумаги ватман № 3. Крышку коробки следует выстлать поролоновой губкой, которую увлажняют, чтобы во время иммунодиффузии в камере поддерживалась влажная атмосфера. Подложки также смачивают раствором электролита, используемым для пропитывания пленок. Полоски фильтровальной бумаги (ватман № 1) шириной 1—2 мм пропитывают антисывороткой, проводя по ним пастеровской пипеткой, которую держат в вертикальном положении. Оптимальное количество антисыворотки и расстояние между полоской с антисывороткой и образцом подбирают эмпирическим путем. Если полоска содержит только часть необходимого количества антисыворотки, то остальной объем наносят уже после того, как полоску помещают на пленку. Оптимальное время диффузии следует определять в предварительных опытах; как правило, для этого требуется 18—48 ч. Линии преципитации не видны на пленках и обнаружить их можно только после окрашивания. С этой целью избыток белка удаляют путем промывания пленки солевым раствором в течение нескольких часов, после чего преципитаты можно окрасить так же, как зоны, получаемые при электрофорезе на ацетате целлюлозы. Лучше всего пользоваться водорастворимыми красителями (пунцовый S или нигрозин).
