Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
На разрешение сильно влияет количество белка в нанесенной пробе. Получение такого большого числа фракций, как в цитированной выше работе, может быть достигнуто лишь при разделении нескольких микрограммов белка; поэтому белки Е. coli были помечены радиоактивными изотопами, а для их обнаружения использовали радиоавтографию (рис. 81).
ИЭФ проводили в геле, находящемся в трубке длиной 130 мм с внутренним диаметром 2,5 мм. В полиакриламидный
Рис. 81. Двухмерный электрофорез белков Е. coli 5333 [935]. Первое направление— изоэлектрофокусирование (ИЭФ) в амфолинах с pH 5—7; второе направление — электрофорез в ДСН-содержащем полиакриламидном геле с градиентом концентрации геля 9—15%. Нанесено около 15 мкг белка (300 000 имп./мин). Белки локализовали методом радиоавтографии.
гель, использованный в первом направлении, добавляли амфо-лины фирмы LKB с диапазоном pH 3—10 и мочевину. После ИЭФ гель уравновешивали с ДСН или помещали на пластину второго геля без всякой обработки. Как до уравновешивания, так и после него гель может храниться при —70 °С в закрытой стеклянной пробирке, заполненной буфером с ДСН. Уравновешивание геля проводили в течение по крайней мере 30 мин, встряхивая его в 5 мл буфера, содержащего 10% глицерина, 5% 2-меркаптоэтанола (объем/объем), 2,3% ДСН (масса/объем) и 62,5 мМ буфер трис-НС1 (pH 6,8). Наилучшие результаты были получены при уравновешивании в течение 2 ч. Во время этой процедуры может происходить небольшое расширение белковых зон и потеря 5—20% белка. Если необходимо полностью избежать потери белка, то гель не следует подвергать какой-либо обработке. В этом случае гель после ИЭФ переносят на пластину второго геля (164X164 мм), причем делают это очень быстро, чтобы предотвратить кристаллизацию мочевины, в результате чего гель становится жестким. Электрофорез
проводят так же, как и с уравновешенными гелями, но в верхний резервуар наливают буфер, содержащий 2%, а не 0,1% ДСН, как в случае уравновешенных гелей. Чтобы быстро запла-витъ первый цилиндрический гель во второй, применяют 1%-ный раствор агарозы. На втором этапе электрофореза наилучшие результаты были получены при использовании экспоненциального градиента концентрации полиакриламидного геля.
Показано, что описанный метод обладает высокой воспроизводимостью и большой разрешающей способностью. Он позволяет обнаружить и количественно определить с помощью радиоавтографии белок, составляющий 10~4—10~5% общего количества белков в образце, что свидетельствует о его высокой чувствительности. Проведение двухмерного электрофореза не требует специального оборудования. Первый этап разделения осуществляют обычно в цилиндрических гелях, для которых подходит любой прибор, предназначенный для диск-электрофореза. Точно так же на втором этапе используют любой тип приборов, пригодных для электрофореза на пластинах геля. Сконструированы также специальные приборы для двухмерного электрофореза. Кальтшмидт и Витманн ,[654] описали прибор, в котором одновременно можно проводить электрофорез на 5 пластинах геля.
Для разделения белков в первом направлении можно использовать не только электрофорез, но и другие методы. Так, например, Пиндер и Гратцер [1008] описали простой и прямой способ последовательного сочетания центрифугирования в градиенте плотности сахарозы и электрофореза в геле. Белки сыворотки человека центрифугировали в градиенте 0—40%-ного раствора сахарозы, содержащего 5% акриламида (2,5% составлял бас-акриламид), ТЕМЭД, (1 мг/мл) и рибофлавин (50 мкг/ /мл). После центрифугирования пробирки облучали люминесцентной лампой для полимеризации акриламида. Чтобы видеть, результаты центрифугирования, один из параллельных гелей окрашивали амидовым черным. Затем из центральной части неокрашенного геля вырезали полоску шириной 2 мм и использовали ее как стартовую зону для электрофореза на пластине 5%-кого полиакриламидного геля при pH 8,5.
Ясно, что заранее трудно сказать, какая из разновидностей двухмерного электрофореза даст наилучшие результаты при разделении той или иной сложной смеси белков. Однако, зная основные принципы электрофоретических методов и некоторые характеристики белков разделяемой смеси, можно довольно хорошо подобрать систему, пригодную для разделения большинства компонентов. В дальнейшем же на основании результатов предварительных опытов электрофоретическая система может быть еще более усовершенствована.
IL4. Иммуноэлектрофорез и родственные методы
Белки обладают антигенными свойствами, что широко используется при их изучении. Реакцию между растворимыми белками и специфическими по отношению к ним преципитирующими антителами проводят в гелях или на пленках из ацетата целлюлозы с помощью различных методов простой или двойной иммунодиффузии. Такие иммунодиффузионные тесты можно применять и к белкам, предварительно разделенным путем электрофореза. В определенных условиях антиген и антитело мигрируют при электрофорезе в противоположных направлениях. Если их движение навстречу друг другу обусловлено электромиграцией, а не диффузией, то такой иммунохимический тест называют электросинерезом (синонимы: встречный электрофорез, иммуноэлектроосмофорез). Количественное определение белков можно осуществлять с помощью электрофореза в среде, содержащей антитела (электроиммуноанализ, электроиммунодиффузия, ракетный иммуноэлектрофорез). Этот метод применяют также для анализа смеси белков, предварительно разделенных в процессе электрофореза (перекрестный иммуноэлектрофорез, перекрестный электрофорез в среде с антителами). Методы иммунопреципитации, обладающие большой чувствительностью, позволяют не только обнаруживать и точно идентифицировать белки, но и проводить их количественное определение. Используя антитела с различной специфичностью, можно проверять белки на наличие или отсутствие у них определенных генетических маркеров или определенных структурных субъединиц. Кроме того, антигенную природу белковых компонентов можно исследовать путем их сравнения с известными антигенами. Таким образом, различные комбинации электрофоретических методик с иммунохимическим анализом служат чрезвычайно эффективным и разносторонним способом изучения свойств белков. Очевидно, что эффективность иммунохимических тестов зависит от специфичности используемых антисывороток, а также от их титра и сродства к антигенам. Для адекватной характеристики антигенов необходимо хорошо знать специфичность применяемой антисыворотки.
