Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Гааль Э. -> "Электрофорез в разделении биологических макромолекул" -> 98

Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.

Гааль Э., Медьеши Г., Верецкеи Л. Электрофорез в разделении биологических макромолекул — М.: Мир, 1982. — 448 c.
Скачать (прямая ссылка): elektroforezvrazdeleniibiologicheskih1982.djvu
Предыдущая << 1 .. 92 93 94 95 96 97 < 98 > 99 100 101 102 103 104 .. 185 >> Следующая

Линия старта
® Гель 2-го направления, содержащий антитела
Ш
Полоски геля 1-го ‘ направления
©
о о о
_ © _
В
Рис. 90. Схематическое изображение перекрестного иммуноэлектрофореза. Л. Метод Лорелла. Б. Метод Минчина-Кларка и Фримера. В. Устройство для проведения электрофореза в первом направлении по Бредвеллу и Барнету
[160].
Анти-КС ЗООмкл
Рис. 91. Перекрестный иммуноэлектрофорез сыворотки козы (А, КС) и лошади (?> ЛС) с использованием кроличьей антисыворотки к белкам сыворотки козы (апти-КС) и лошади (анти-ЛС) соответственно. Для сравнения приводятся окрашенные электрофореграммы первого направления. [С любезного разрешения д-ра G. Kocsis (Будапешт).]
позволяет осуществлять анализ известных количеств белков и, таким образом, обеспечивает возможность количественного сравнения компонентов на разных пластинках.
Если для разделения белков в первом направлении прибегают к изоэлектрофокусированию (перекрестное иммуноэлектрофокусирование), то возникает ряд проблем. Агароза является мало подходящей средой для ИЭФ, поскольку этот метод требует среды, в которой отсутствует электроосмос (см. разд. 1.12.2). Можно, конечно, использовать для ИЭФ полиакриламидный гель, а разделение во втором направлении проводить в агарозном геле, содержащем антитела. Однако, как будет видно из дальнейшего изложения, применение разных сред также имеет ряд недостатков. Один из возможных путей решения этой проблемы заключается в приготовлении агарозы, из которой получается гель почти с нулевым зарядом (см. разд. 1.9.2). В этом случае весь анализ (изоэлектрофокусирование и последующий электрофорез в геле, содержащем антитела) можно проводить в агарозном геле. Таким способом осуществляли перекрестное иммуноэлектрофокусирование Иохансон и Иертен [631], а также Вейс и др. [1392]. Первые авторы проводили электрофорез во втором направлении при pH 8,2—8,6, так как в применяемой ими среде подвижность антител при этом pH была близка к нулю.
Замечания по технике проведения перекрестного иммуноэлектрофореза. В оригинальной методике Лорелла [739] при электрофорезе в первом направлении рекомендуется вырезать канавку для образца размером 1ХЮ мм. Кроме того, необходимо использовать буфер, обладающий не слишком низкой ионной силой (например 70 мМ вероналовый буфер, pH8,6), и высокое напряжение (до 20 В/см) с эффективным охлаждением системы. Для электрофореза во втором направлении из центральной части электрофореграммы вырезают полоску шириной 2—5 мм и переносят ее на пластинку геля, которую готовят па способу, рекомендуемому для электроиммуноанализа [741]. Разрезать гель следует по линейке острой и тонкой бритвой, чтобы уменьшить выделение жидкости с поверхности среза. В геле, содержащем антитела, делают два параллельных разреза недалеко от его катодного конца. Перенос полоски геля является очень ответственным этапом. Предварительно со стеклянной пластинки удаляют весь окружающий гель, а капли жидкости высушивают фильтровальной бумагой. Полоску геля переносят с помощью тонкого стального лезвия на край тонкого предметного стекла. Затем прилипшую к нему полоску геля переносят в канавку, вырезанную в геле для второго направления (рис. 90, Л). Оба этапа электрофореза проводят на пластинках геля размером 10X20 см. Второй гель может вмещать две или больше по-
256 II. Электрофорез белков ,
------------------------------^-----------------------------i
лосок, перенесенных с первого геля (в зависимости от длины? электрофореграммы, полученной в первом направлении). Соот*^ ветствующую концентрацию антисыворотки подбирают эмпирическим путем; обычно она бывает в 1,5—2 раза выше оптимальной концентрации, используемой для электроиммуноанализа. Антиген, концентрация которого может варьировать в пределах 50—500 мкг/мл, вносят в гель первого направления в объеме 10 мкл -(на второй гель переносят около одной трети указанного количества). Соотношение количеств антигена и антител должно быть подобрано таким образом, чтобы пики преципитации были высотой 10—30 мм. Более высокие пики могут ухудшить разрешение, а слишком малые трудно использовать для количественного определения.
В модифицированном методе [873] оба этапа электрофореза проводят на стеклянных пластинках размером 8ХЮ см. Для антигенов вырезают четыре круглые лунки. На первом этапе электрофореза, осуществляемом при напряжении 10—15 В/см, применяют охлаждение. После завершения электрофореза по краям пластинки удаляют слой геля шириной 10 мм, а остальной гель разрезают на четыре полоски, параллельно направлению электрофореза. Тонким лезвием бритвы каждую полоску переносят на стеклянную пластинку такого же размера, как и первая (рис. 90,5). Полоску геля помещают на край пластинки, а ее свободную поверхность заливают агарозой, содержащей антитела. После того, как второй гель застынет, проводят электрофорез во втором направлении при низком напряжении (2— 2,5 В/см) в течение 18—22 ч.
Предыдущая << 1 .. 92 93 94 95 96 97 < 98 > 99 100 101 102 103 104 .. 185 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed