Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
ее агаровым золем, содержащим антитела в относительно низкой концентрации. После того как в геле, содержащем антитела, образуются преципитаты, измеряют расстояние, на которое переместился их передний край (подробное описание методики см. [81].
По методу, предложенному Альфонсо [7, 8], точно измеренный объем раствора антигена подвергают электрофорезу. Затем пластинки оставляют на некоторое время, чтобы дать материалу, разделившемуся при электрофорезе, диффундировать, после чего поверхность геля дважды в течение 1 ч покрывают антисывороткой (4—5 мкл/см2). Образуются зоны преципитации круглой или овальной формы. Количество антигена рассчитывают по величине поперечного диаметра этих зон.
Электрофоретически разделенные антигены можно сравнивать с известными антигенами по принципу двойной иммунодиффузии. Экспериментальные подходы для таких исследований предложены несколькими авторами. Методика Хереманса и др, [551] позволяет сравнивать некоторые компоненты двух смесей антигенов, предварительно подвергнутых электрофорезу. С этой целью канавку с антителами укорачивают или прерывают участком геля, не содержащим антител, что позволяет соответствующим зонам преципитации взаимодействовать между собой, В результате на иммуноэлектрофореграмме возникает картина, указывающая на полную или частичную идентичность либо на неидентичность сравниваемых антигенов [952] (рис. 86). Оссер-
Рис. 86. Сравнение антигенов «методом прерванной канавки» [551]. Слияние преципитатов указывает на антигенную идентичность.
ман [946] и Хансон [512] применили другую методику, согласно которой по обеим сторонам электрофоретически разделенных антигенов вырезают продольные канавки. Одну канавку заполняют иммунной сывороткой, а другую — раствором стандартного антигена (рис. 87). Вдоль этих канавок между стандартным антигеном и соответствующими антителами образуется сплошная линия преципитации. Если в анализируемой смеси присутствует антиген, родственный стандартному, то происходит реакция, указывающая на полную или частичную идентичность этих антигенов. Следует отметить, что при сравнительной иммунодиффузии тот или иной характер взаимодействия между двумя антигенами обусловлен не только их свойствами, но и специфичностью используемой иммунной сыворотки. Если наблюдается реакция, свидетельствующая о полной идентичности двух антигенов, то, строго говоря, это означает, что данная антисы-воротка не обнаруживает между ними никаких различий. Однако это вовсе не исключает возможности того, что один из сравниваемых антигенов имеет антигенную детерминанту, которая ртсутствует у другого и может быть обнаружена при использовании другой иммунной сыворотки.
Эталонный
антиген
— Аитисыворотка
Рис. 87. Сравнение антигенов по методу Оссермана [946] и Хансона [512]. Форма линий преципитации при отсутствии идентичности (/), при частичной идентичности (2\ антиген содержит не все антигенные детерминанты, присутствующие в стандартном антигене) и при полной идентичности (<?).
t t
2 .3
ИММУНОДИФФУЗИЯ в АГАРОВОМ (АГАРОЗНОМ) ГЕЛЕ ПОСЛЕ ПРОВЕДЕНИЯ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА В ДРУГОЙ СРЕДЕ
Агаровый или агарозный гель является наиболее подходящей средой для иммунодиффузии. В «классическом» варианте иммуноэлектрофореза и электрофорез, и иммунодиффузию осуществляют в одном и том же геле. Однако во многих случаях иммунодиффузию приходится проводить уже после того, как макромолекулы были разделены в другой среде, менее подходящей для иммунодиффузии. Паулик [1027] еще в 1852 г. применил иммунодиффузию для анализа антигенов, разделенных с помощью электрофореза на бумаге. Хотя иммунодиффузию можно осуществлять и на ацетате целлюлозы (см. ниже), Кон [695] предложил переносить антигены с ацетата целлюлозы в агаровый гель вместо того, чтобы проводить весь иммуноэлектрофо-ретический анализ на ацетате целлюлозы. Пленку из ацетата целлюлозы, на которой антигены подвергали электрофорезу» разрезают на две половинки; одну из них окрашивают, а из другой вырезают полоску шириной 1 см (на расстоянии 1 см от центральной линии) и помещают ее на поверхность заранее приготовленного агарового геля, следя за тем, чтобы под ней не образовывались пузырьки воздуха. Можно также быстро окрасить одну половинку полоски, а вторую разрезать на кусочки, так чтобы каждый из них содержал отдельную электрофоретическую фракцию. Эти кусочки пленки помещают на поверхность агарового геля, оставляя между ними промежутки в несколько миллиметров. Пропитанные соответствующей антисывороткой полоски фильтровальной бумаги шириной 2 мм кладут на гель параллельно кусочкам пленки и на оптимальном расстоянии от них. Это расстояние определяется теми же факторами, что и в случае иммуноэлектрофореза в агаровом геле. После завершения иммунодиффузии с поверхности геля удаляют полоски бумаги и кусочки пленки, а затем фотографируют полученную картину преципитации. Для приготовления стабильных препаратов гель высушивают и окрашивают по методике, предназначенной для иммуноэлектрофореграмм в агаре. Удаление лишних белков перед высушиванием геля, как правило, не является обязательным.
