Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Гааль Э. -> "Электрофорез в разделении биологических макромолекул" -> 100

Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.

Гааль Э., Медьеши Г., Верецкеи Л. Электрофорез в разделении биологических макромолекул — М.: Мир, 1982. — 448 c.
Скачать (прямая ссылка): elektroforezvrazdeleniibiologicheskih1982.djvu
Предыдущая << 1 .. 94 95 96 97 98 99 < 100 > 101 102 103 104 105 106 .. 185 >> Следующая

Рис. 93. Электрофоретическая камера для полуавтоматического микрометода перекрестного иммуноэлектрофореза, сконструированная Дэвисом и др. [279]. Основной блок, позволяющий проводить электрофорез в обоих направлениях на одной пластинке, состоит из четырех резервуаров (А—Г). Подсоединение дополнительных модулей (Д и Я) дает возможность проводить электрофорез на нескольких пластинках одновременно. Стрелки на электрофоретических пластинках (Я) указывают направление тока при электрофорезе в первом направлении. Стрелки при цифрах 1 и 2 обозначают контакты соответственно первого и второго направлений.
рофореза в геле, содержащем антитела. Если при разделении в первом направлении каждый образец наносят в виде двух параллельных проб, то одну из них можно окрасить сразу после электрофореза.
Дэвис и др. [279] разработали полуавтоматическую микротехнику для повседневных анализов. Они предлагают пользоваться пластинками, предварительно покрытыми слоем геля. Гель разрезают на полоски шириной 1 см и каждую из них переносят на новую пластинку, свободную поверхность которой заливают агарозным гелем, содержащим антитела. Электрофорез осуществляют в приборе, позволяющем переключать ток с первого направления на второе путем простого изменения электрических контактов, не прикасаясь к пластинкам (рис. 93).
Была предложена [160] техническая модификация микрометода перекрестного иммуноэлектрофореза, которая дает возможность получать прямую базовую линию для всех преципитатов. Перед электрофорезом в первом направлении гель разрезают на полоски, оставляя между ними промежутки в несколько миллиметров. Круглую лунку для образца вырезают с той стороны полоски, которая должна примыкать к гелю, содержащему антитела (рис. 90,В). По данным авторов, такая модификация улучшает разрешение.
ПЕРЕКРЕСТНЫЙ ИММУНОЭЛЕКТРОФОРЕЗ И ПЕРЕКРЕСТНОЕ ИММУНОИЗОЭЛЕКТРОФОКУСИРОВАНИЕ С ПРИМЕНЕНИЕМ РАЗНЫХ СРЕД В ПЕРВОМ И ВТОРОМ НАПРАВЛЕНИЯХ
В 1966 г. появились первые сообщения об использовании при электрофорезе крахмального геля в первом направлении и агарозного — во втором [725, 744]. Фагерхол и Лорелл [356] описали сочетание диск-электрофореза в крахмальном геле с электрофорезом в агарозном геле, содержащем антитела к ан-титрипсину, причем они обнаружили 12 хорошо разделившихся фенотипических вариантов (см. рис. 106). Крахмальный гель разрезали в горизонтальном направлении и из нижнего слоя (толщиной 2 мм) вырезали полоски шириной 2 мм, которые помещали в канавки, сделанные в геле, содержащем антитела. Пространство между краями крахмального и агарозного гелей заполняли жидкой агарозой, нагретой до 45 °С.
Более многочисленны работы, в которых для электрофореза в первом направлении применяли полиакриламидный гель, а во втором — агарозный. Авторы отмечают трудности, связанные с относительно большим эндосмотическим током жидкости, наблюдающимся при использовании даже хороших препаратов агарозы, имеющихся в продаже. Это может привести к серьезному нарушению миграции белков из полиакриламидного геля в агарозный, поскольку в первом геле электроосмос практически отсутствует. Если на стыке между гелями возникнет избыточный ток буфера, то может произойти даже разделение соприкасающихся поверхностей гелей. Чтобы избежать этих осложнений, весь анализ следует проводить в полиакриламидном геле. Детерман и Уолч [293] пытались приспособить для проведения иммунопреципитации крупнопористый полиакриламидный гель с повышенным содержанием бас-акриламида. Однако преципитаты получались в нем менее четкие, чем в агарозном геле. Большинство авторов применяют во втором направлении агарозный гель, обладающий пониженной способностью к эндосмосу. Иоханссон и Стенфлоу [633] использовали агарозу, очищенную на ДЭАЭ-целлюлозе от компонентов, несущих большие отрицательные заряды. Для дальнейшего уменьшения электроэндосмоса повышали вязкость агарозного геля, добавляя к нему метилцеллюлозу (мол. масса 200 000). Лундалл и Лильяс [787] применили агарозу, очищенную на QAE-сефадексе [632] и содержащую 0,04% серы. Они получили удовлетворительные результаты без добавления к гелю агентов, повышающих его вязкость. Чтобы избежать образования градиентов проводимости и pH, авторы вымачивали вырезанный кусок полиакриламидного геля в течение 15 мин в буфере, используемом для электрофореза во втором направлении. Этот гель помещали на стеклянную пластинку и всю ее поверхность между гелем и концом,
обращенным к катоду, заливали забуференной агарозой без антител. Чтобы предотвратить преципитацию белков в полиакриламидном геле, с другой его стороны с помощью временной прокладки отделяли узкую часть пластинки и покрывали ее тем же раствором агарозы. На остальной поверхности стеклянной пластинки формировали гель, содержащий антитела. В той же работе описан другой способ устранения трудностей, возникающих при электрофоретическом переносе белков из одной среды в другую. Полоску агарозного геля накладывают на кусок, вырезанный из полиакриламидного геля, и помещают их во влажную камеру, чтобы разделенные белки диффундировали из полиакриламидного в агарозный гель. Как сообщают авторы, при таком способе получаются четкие преципитаты с хорошим разрешением, однако степень диффузии белков варьирует в зависимости от размеров и формы молекулы. Было обнаружено, что при 30 °С за 1 ч в агарозу переходит 20% альбумина.
Предыдущая << 1 .. 94 95 96 97 98 99 < 100 > 101 102 103 104 105 106 .. 185 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed