Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
ОЧИСТКА ВЕЩЕСТВ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПОЛИАКРИЛАМИДНОГО ГЕЛЯ
Чистота составных компонентов полиакриламидного геля может сильно варьировать в зависимости от источника их получения. Для очистки акриламида предложено несколько методов. В одном из них [777] акриламид перекристаллизовывают из хлороформа. Для этого 70 г акриламида растворяют в 1 л хлороформа при 50 °С. Горячий раствор фильтруют без отсасывания и охлаждают до —20°С. Образовавшиеся кристаллы отфильтровывают на охлажденной воронке, промывают холодным хлороформом или гептаном, или смесью обоих растворителей и высушивают.
Согласно другому методу очистки [1231], 3 кг акриламида растворяют в 2 л воды при небольшом нагревании. После охлаждения раствора до комнатной температуры его фильтруют на воронке Бюхнера, температуру доводят до 4°С и отделяют выпавшие кристаллы. Оставшийся маточный раствор может быть использован в качестве исходного раствора акриламида, если его обработать активированным углем (1 г/л) при 60°С в течение 1 ч, а затем отфильтровать. Концентрацию акриламида в нем можно определить по показателю преломления в соответствии с уравнением
(П420 _ ] ^ ЪЩ
Объем/масса % = —I-46^Т0-з—’
В своей прекрасной книге, посвященной электрофорезу в полиакриламидном геле, Маурер [839] приводит детальное описание метода очистки акриламида, разработанного Алленом [18]. 90 г акриламида растворяют в смеси 300 мл этилацетата и 300 мл бензола, раствор нагревают до 70°С, фильтруют горячим и дают остьпь до 20 °С. Образовавшиеся кристаллы от-
деляют фильтрованием под вакуумом, высушивая их таким способом до исчезновения запаха бензола, и вновь растворяют :в 540 мл хлороформа при 60 °С. Полученный раствор опять фильтруют горячим и охлаждают до температуры не ниже + 22 °С. Выпавшие кристаллы желательно хранить под слоем хлороформа и высушивать фильтрованием под вакуумом лишь леред употреблением. Водные растворы кристаллического акриламида далжны иметь pH 4,9—5,2, и их можно использовать до тех пор/ пока pH не изменится более чем на 0,4 единицы.
Еще один метод перекристаллизации акриламида заключается в том, что 'к отфильтрованному раствору акриламида в ацетоне добавляют 3 объема бензола [1177].
Акриловая кислота, которая может снижать электрофоретическую подвижность некоторых белков [1064], полностью не удаляется перекристаллизацией. Для освобождения от нее предложено использовать ионообменную хроматографию [839] при условии, что будут приняты необходимые меры, препятствующие полимеризации акриламида.
Перекристаллизация бис-акриламида [777]. Бис- акрил амид растворяют в ацетоне при 40—50 °С до концентрации 10 г/л, горячий раствор фильтруют и медленно охлаждают до —20 °С. .Выпавшие кристаллы промывают охлажденным ацетоном и высушивают в вакууме.
Очистка ДСП [259, 1134]. 300 г ДСН растворяют в 7 л кипящего этанола и гарячий раствор фильтруют на воронке Бюхнера через лист целита. ДСН кристаллизуют при 0°С или ниже.
Деионизация мочевины. 1 л 10 М мочевины перемешивают в течение 1 ч с 30—100 мл смеси ионообменных смол, фильтруют и хранят при 3—6°С. В некоторых случаях более целесообразно обработать мочевину активированным углем. Полноту удаления ионов можно проверить путем измерения электропроводности раствора.
Определение концентрации веществ, применяемых для приготовления гелей. Концентрацию органических веществ, содержащих азот, определяют по Кьельдалю. Для количественного определения акриламида разработан потенциометрический метод [1433]. Можно использовать также приемы, основанные на насыщении двойной связи.
Приведем методику определения содержания акриламида и ^«с-акриламида по Мауреру [839]. Необходимые реактивы: Ю,1 н. КВгОз—КВг (2,79 г КВг03+Ю КВг в 1 л раствора); 6 н. H2S04; 20%-ный раствор KI; ОД н. Na2S203; 1%-ный раствор крахмала.
Взвешенный образец (1,0—1,5 г) растворяют в воде и доводят объем до 500 мл. 25 мл этого раствора смешивают с 25 мл 0,1 н. КВгОз— КВг в колбе для иодирования на 250 мл, снаб-
женной пробкой с двумя отверстиями, делительной воронкой и стеклянным отводом для создания вакуума. После подключения вакуума при давлении около 12 мм Hg в колбу по каплям добавляют 6 н. H2S04, смесь при частом встряхивании выдерживают 20 мин в темноте, затем приливают к ней 15 мл раствора KI, после чего вакуум отключают и раствор немедленно титруют, используя крахмал в качестве индикатора. Для расчета применяют следующую формулу:
Концентрация вещества, % =• о^разец^г ’
где х и у — количество мл 0,1 н. ЫагЭгОз, пошедшего на титрование соответственно контрольной и опытной пробы, величина г для акрила'мида равна 3,554, а для быс-акриламида — 3,854.
ТЕМЭД анализируют при помощи газовой хроматографии.
Концентрацию ДСН можно определять методами газовой хроматографии [1187] или спектрофотометрии [529, 662, 888, 1013, 1081, 1364].
В растворах мочевины может образовываться цианат, вызывающий карбамилирование белков, степень которого зависит от pH и температуры [241]. Для определения содержания циа-ната в растворах существует специальный метод [1459].
