Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
ПРИГОТОВЛЕНИЕ ЦИЛИНДРИЧЕСКИХ ГЕЛЕЙ
Для получения раствора разделяющего геля смешивают его компоненты. Перед добавлением персульфата из раствора удаляют под вакуумом воздух, так как, во-первых, даже следы молекулярного кислорода подавляют процесс полимеризации и, во-вторых, в результате образования тепла во время электрофореза другие газы, присутствующие в геле, выделяются в виде пузырьков и искажают условия проведения опыта. После добавления персульфата раствор геля заливают в трубки до высоты около 50 мм и сверху аккуратно наслаивают воду, которая препятствует образованию мениска, т. е. искривлению поверхности геля, и одновременно мешает доступу атмосферного кислорода, тормозящего полимеризацию. Для устранения влияния кислорода гель даже помещают в атмосферу азота [1310]. Полимеризация обычно начинается примерно через 20 мин и заканчивается через 45 мин. После этого воду с поверхности геля тщательно отсасывают при помощи шприца с иголкой или пипетки, а остатки воды удаляют фитильком из фильтровальной бумаги или целлюлозно-ацетатной пленки. Далее поверхность разделяющего геля ополаскивают небольшим количеством раствора концентрирующего геля, который наливают затем в трубку на высоту 10 мм и сверху вновь аккуратно покрывают водой. Трубки облучают флуоресцентной лампой дневного света или просто выставляют на солнечный свет на 20—30 мин в таких условиях, чтобы они не нагревались. Полимеризация начинается примерно через 5 мин после 'начала облучения (в зависимости от его интенсивности), о чем свидетельствует появление опалесценции. По окончании полимеризации слой воды удаляют, поверхность концентрирующего геля ополаскивают буферным раствором и наносят на нее исследуемую пробу. После этого трубки доверху осторожно заполняют электродным буфером, стараясь его не перемешать с более плотным раствором, содержащим пробу. Можно также сначала налить на концентрирующий гель электродный буфер, а затем под него подслоить пробу. Если же образец содержит компоненты геля, то его также полимеризуют при облучении светом.
Описанный 'метод приготовления геля довольно прост, но иногда он приводит к появлению искривленных зон вследствие
неравномерного образования геля или уменьшения его объема в процессе полимеризации. Возникновения подобных явлений можно избежать, если сначала готовить не разделяющий, а концентрирующий гель. Для этого в резиновый колпачок, в который позднее вставляют трубку, или прямо в трубку с закрытым снизу отверстием наливают 40%-ный раствор сахарозы в используемом для электрофореза буфере так, чтобы его высота в трубке составляла около 10 мм. При помощи шприца с иголкой из нержавеющей стали на этот раствор аккуратно наслаивают 0,15 мл раствора концентрирующего геля, избегая перемешивания двух фаз. Сразу же раствор геля покрывают слоем воды (0,15 мл) и подвергают фотополимеризации. Затем воду удаляют, как описано выше, поверхность концентрирующего геля промывают небольшим количеством раствора разделяющего геля, которым и заполняют трубку до верхнего края. Если у этого края полимеризация запаздывает, то трубку можно накрыть маленьким кусочком 'полимерной пленки, удалив из-под нее пузырьки воздуха. Когда гель застынет, трубку вынимают из резинового колпачка или снимают наклеенное дно и вновь устанавливают вертикально в другой колпачок или соответствующую подставку так, чтобы разделяющий гель оказался внизу. Раствор сахарозы удаляют кусочком фильтровальной бумаги и поверхность концентрирующего геля промывают буфером, использованным для разведения пробы. Пробу наносят, как описано выше.
Приготовление пробы. По мнению Дэвиса [281], включение исследуемой ггробы в стартовый гель препятствует тепловой конвекции .и диффузии веществ, что приводит к более эффективному разделению. Однако некоторые белки повреждаются в результате полимеризации геля [1407] или под действием флуоресценции [975]. Кроме того, белки могут подавлять полимеризацию геля [570]. Если есть подозрение, что флуоресценция или персульфат (см. ниже) приводят к возникновению артефактов, вместо стартового геля желательно использовать суспензию сефадекса G-200, глицерин, сахарозу или мочевину. В то же время эти материалы сами способны при определенных условиях стать причиной артефактов. Так, сефадекс G-200 может задерживать движение белков [173], а сахароза — взаимодействовать с 8-аминогруп'пой лизина [455] или боратом с образованием отрицательно заряженного комплекса. Поэтому присутствие сахарозы в боратном буфере может привести к «эффекту усеченного конуса» и боковому распространению белков в процессе электрофореза [759]. С другой стороны, мочевина вызывает диссоциацию белков на субъединицы, препятствует затвердению агарозы в агарозно-полиакриламидных гелях [574] и влияет на активность водородных ионов.
7—2295
Для того чтобы предотвратить диффузию компонентов пробы вверх и тепловую конвекцию, было предложено [912] помещать над пробой еще один слой геля. Рекомендуется исследуемые вещества растворять в том же буфере, на котором приготовлен концентрирующий гель. Если образец сильно разведен, то для концентрирования белков путем изотахофореза [281] или методом скачка напряжения [570] требуется более толстый слой концентрирующего геля. В случае высокого исходного содержания солей в анализируемом препарате следует либо удалить их с помощью диализа, гель-фильтрации или каким-то другим способом, либо, если позволяет концентрация макромолекул, развести пробу. Для получения воспроизводимых результатов необходимо, чтобы во всех опытах наносимый раствор имел совершенно одинаковые ионную силу, pH и объем.
