Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Изучение влияния >1,М'-диаллилтартардиамида (ДАТД) на структуру полиакриламидного геля [94] показало, что при использовании этого сшивающего агента гели получаются в целом с более крупными порами, чем в случае применения бис-акриламида. Авторы считают, что при необходимости иметь достаточно большие поры для изоэлектрофокусирования и изота-хофореза макромолекул с мол. массой до 500000 можно использовать гели с большим числом поперечных сшивок, полученные с помощью ДАТД (5% Г, 15% С). Кроме того, добавление 0,3—3% ДАТД к б«с-акриламиду приводит к тому, что гель лучше прилипает к стенкам камеры и -при этом размеры лор не уменьшаются.
ПОЛИМЕРИЗАЦИЯ И КАТАЛИЗАТОРЫ ’
Полимеризацию акриламида можно проводить химическим или фотохимическим методом. Наиболее часто применяются следующие системы химических катализаторов: а) персульфат аммония — М^М'^'-тетраметилэтилендиамин (ТЕМЭД); б) персульфат аммония — 3-диметиламинопропионитрил (ДМАПН) в) перекись водорода — сульфат железа — аскорбиновая кислота [644].
Персульфат аммония нестоек в водном растворе, поэтому было предложено [229] заменить его персульфатом калия.
Процесс полимеризации требует наличия свободных радикалов мономера, которые образуются при основном катализе пот действием свободных радикалов кислорода, выделяемых персульфатом. Поскольку для реакции необходимо свободное основание, полимеризация не идет при низких значениях pH. Если же требуется гель в буфере с низким pH, то полимеризацию следует проводить либо по методу Йордана и Реймонда [644], либо при более высоких значениях pH, а необходимый буфер можно ввести потом в гель путем диффузии или электрофореза. Молекулярный кислород замедляет или вовсе предотвращает полимеризацию, поэтому для получения воспроизводимых результатов его необходимо удалять. Это явление было даже использовано для измерения содержания кислорода в крови [390]. Наличие примесей в реактивах, а также температура, при которой проводят реакцию, тоже влияют на скорость полимеризации.
Фотополимеризацию акриламида осуществляют в присутствии рибофлавина и ТЕМЭД. По сравнению с другими красителями рибофлавин обладает уникальным свойством, заключающимся в том, что входящий в его состав рибозный остаток действует как внутренний восстанавливающий агент. В отличие от химической полимеризации фотохимическая реакция требует наличия в среде следов молекулярного кислорода (около 1% в газовой смеси). Возбужденный светом краситель в присутствии донора водорода подвергается восстановлению, а молекулярный кислород окисляет эту восстановленную форму рибофлавина, которая в свою очередь участвует в образовании веществ, необходимых для инициирования полимеризации ак-риламида [947].
В растворах мономеров могут находиться различные буферные ионы, а также такие денатурирующие агенты, как мочевина, ДСН или другие детергейты. Все эти соединения обычно либо совсем не влияют на образование геля, либо лишь слегка изменяют время его застывания.
ПЛОТНОСТЬ ГЕЛЯ (РАЗМЕРЫ ПОР)
Полиакриламидный гель служит при электрофорезе не только поддерживающей средой, но и сам принимает активное участие в процессе разделения макромолекул благодаря так называемому эффекту молекулярного сита. Многими экспериментами было доказано, что чем выше концентрация акриламида, тем Меньше средний размер пор в геле.
Реймонд и Накамичи [1064] высказали предположение, что
средний размер пор в геле (р) обратно пропорционален квадратному корню из объемной концентрации (с) полимера с диаметром молекулы d:
отсюда получаем
где k — фактор, зависящий от геометрии геля; d и р измеряются в А. Если считать, что поперечные сшивки расположены примерно под прямыми углами к цепям полимера, то 6=1,5.
Для расчета размера пор в полиакриламидном геле можно использовать также уравнение Смитиса [1201], выведенное им ранее для определения зависимости размера пор от концентрации крахмала (см. гл. 1.10).
Еще одну попытку связать между собой величины р, d и с предпринял Томбс [1296], предложивший следующее уравнение:
Обычно определение размера пор производят на основе электрофоретического или хроматографического исследования белков или нуклеиновых кислот [366, 1087, 1296]. Но поскольку конформация этих макромолекул точно не известна, расчеты, основанные «а изучении их поведения, могут оказаться ошибочными. К тому же нельзя пренебрегать и влиянием бис-акриламида на средний радиус пор [131, 366, 538, 1109] (рис. 29).
Исходя из анализа большого числа работ, можно сделать вывод, что в настоящее время нет такой математической формулы, которая могла бы точно описать зависимость между концентрацией акриламида и плотностью геля.
Связь между подвижностью, плотностью геля и его концентрацией. Из рассмотренной выше теории размера пор ясно, что подвижность макромолекул связана обратной зависимостью со
c=tk2d2/p2f
(5)
(6)
Рис. 29. Зависимость средне- Рис. 30. Зависимость логарифма относительном
го радиуса пор (#0,5) от подвижности белков (7?[) от концентрации ге-
