Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
концентрации геля [229,366]. ля при постоянном относительном содержании бас-акриламида (5%) [229]. О бромфено-
лотзый синий, ? яичный альбумин, Д бычий сывороточный альбумин, ф димер бычьего сывороточного альбумина.
средним размером пор. Фергюсон [376] отложил на графике логарифмы относительной подвижности белков против концентрации крахмального геля и обнаружил между ними линейную зависимость. Такая же зависимость наблюдается и в случае применения полиакриламидного геля [229, 1289] (рис. 30). Из этого графика можно получить два важных параметра: пере' сечение прямой с осью ординат дает подвижность данной макромолекулы в свободном растворе U0, а ее наклон равен коэффициенту задержки Кг- Подвижность макромолекулы (U) при данной концентрации мономера (Т) может быть выражена в виде
lgt/ = Igt/0-*r7\ (7)
т. е. подвижность макромолекулы определяется плотностью геля (концентрацией Мономеров). Если проанализировать движение макромолекул при электрофорезе в двух полиакриламидных гелях с различными средними размерами пор (все прочие условия одинаковы), то можно получить следующие величины
подвижности макромолекул:
Ui~ QXfji при концентрации геля 7\ (8)
И
U2—QXlf2 при концентрации геля Т2, (9)
где Q — суммарный заряд макромолекулы, X — ионная сила геля, Ui и U2 — подвижности макромолекулы, а fy и /2 — коэф-
фициенты прения макромолекулы при концентрациях геля соответственно Г1 и Т2. Из уравнений (8) и (9) получаем
<10)
т. е. подвижности определяются коэффициентами трения, которые включают в себя все факторы, влияющие на подвижность макромолекул при электрофорезе в полиакриламидном геле. Так как константа диффузии D и коэффициент трения связаны между собой соотношением
D=KT/f, (11)
где К — постоянная Больцмана, а Т — абсолютная температура, константу диффузии можно определить путем проведения
электрофореза с использованием полиакриламидных гелей разных концентраций, но с сохранением всех остальных условий опыта одинаковыми. Если же константа диффузии известна для одного вещества, то для другого ее можно найти из отношения их подвижностей
A- ik-A.
(12)
Рис. St. Распределение размеров пор в двух гелях [1297]. Pl — лимитирующий размер пор. Подвижность молекулы белка с размерами, равными лимитирующему размеру пор, пропорциональна заштрихованной площади, представляющей собой ту часть пор, через которую молекула может проникнуть.
Однако при этом не следует исключать возможности того, что в процессе электрофореза макромолекулы способны изгибать волокна геля, так как белки, обладающие весьма малой скоростью диффузии в гелях, быстро проходят через них под действием электрического поля [449].
С, °/о
Рис. 32. Зависимость коэффициента задержки Кг различных белков от количества агента, образующего поперечные сшивки в полркриламидных гелях [1109]. Д фибриноген; ф липопротеид с низкой плотностью; Ў фикоэритрин; ? гемоглобин А и S; О бычий сывороточный альбумин.
Исходя из теоретических соображений, можно предположить, что размеры пор в геле подчиняются гауссову распределению со стандартным отклонением о\ величина которого не зависит от концентрации геля, и что для данной макромолекулы существует лимитирующий размер пор PL. Через поры такого размера она уже не может проникнуть. Тогда подвижность макромолекулы должна быть пропорциональна числу пор с размерами, большими чем PL (рис. 31), и может быть рассчитана из уравнения
Л. ___п р) /1 о\
где Q — стандартный интеграл вероятности, имеющий вид
оо
(14)
X
Согласно уравнению (14), всегда должна существовать такая концентрация геля, при которой р будет равно Pl. В этом случае подвижность макромолекулы будет равна половине ее подвижности в свободном растворе:
U=0,5Uo. (15)
Зная величину Pl, можно сделать заключения относительно
6—2295
размеров, формы и, с некоторыми допущениями, молекулярной-массы макромолекулы [1297].
Как уже отмечалось выше, изучая подвижность макромолекул, нельзя не учитывать содержания бмс-акриламида в геле. Родбард и др. [1109] детально исследовали, как изменяется график Фергюсона в зависимости от концентрации быс-акрил-амида в гелях, содержащих 7,5% Г. На рис. 32 показано, что величина /С/возрастает с повышением С до 5—8%, после чего падает. При значениях С от 10 до 50% Кт для всех белков асимптотически приближается к нулю. Величина t/0 имеет максимум также при концентрации С около 10%, а при более высоких концентрациях достигает плато на уровне, характерном для каждого отдельного белка, причем этот уровень во всех случаях ниже значения t/о, полученного экстраполяцией соответствующей кривой к нулевой концентрации С (рис. 33).
