Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
теристик. Очень крупные (например, иммуноглобулин М) или асимметричные (например, фибриноген) молекулы не проникают 'В крахмальный гель, в то время как глобулярные белки с малой молекулярной массой перемещаются в нем так же, как в среде, не обладающей свойствами молекулярного сита. Диффузия белков в крахмальном -геле протекает крайне медленно. Оказалось, что размеры пор в условиях электрофореза больше, чем их размеры, вычисленные на основании измерения скорости диффузии белков [449, с. 15]. По-видимому, сеть полисахаридных цепей, образующая матрикс геля, не является жесткой и обладает достаточной подвижностью, чтобы изгибаться, когда молекулы белков движутся через -нее в электрическом поле. Эта особенность крахмала делает его превосходной антиконвекционной средой, пригодной для разделения компонентов, мало различающихся по электрофоретической подвижности. В крахмале содержится некоторое количество отрицательно заряженных боковых цепей, вследствие чего он обладает слабыми ионообменными свойствами. В некоторых случаях эти небольшие адсорбционные силы могут влиять на перемещение белков.
ГИДРОЛИЗ КРАХМАЛА
Согласно описанной методике [1031], гранулированный картофельный крах1мал обрабатывают в течение нужного времени при 37 °С ацетоном, содержащим НС1. Для приготовления этого раствора к 100 объемам химически чистого ацетона добавляют 1 объем концентрированной НС1 и раствор выдерживают в течение ночи при 37 °С. Для проведения гидролиза к 30 г крахмала добавляют 60 мл омеси ацетон — НС!. Реакцию останавливают, приливая к гидролизату 15 мл 1 М водного раствора СНзСОСЖа. Крахмал тщательно отмывают водой на воронке Бюхнера, после чего промывают ацетоном и высушивают .на воздухе. Оптимальное время гидролиза необходимо определять для каждой партии крахмала. Для этого серию проб по 30 г гидролизуют в течение разных периодов времени (от
0,5 до 2,5 ч) и оценивают механические свойства полученного из них 14%-ного геля.
При изучении условий гидролиза [988] 'было показано, что реакцию можно проводить при любой температуре между 30 и 40 °С, но колебания выбранной температуры в ходе реакции не должны превышать 0,2 °С, потому что такое отклонение температуры эквивалентно изменению продолжительности гидролиза на 5 мин. Гидролизованный крахмал для электрофореза имеется и в продаже.
ПРИГОТОВЛЕНИЕ ГЕЛЯ ИЗ ГИДРОЛИЗОВАННОГО КРАХМАЛА
Оптимальную концентрацию геля нужно находить для каждой партии гидролизованного крахмала. Определенное количество крахмала суспендируют в соответствующем объеме буфера в термостойкой и желательно круглодонной колбе, которую затем при постоянном помешивании (вручную) нагревают на газовой горелое (при этом удобно пользоваться асбестовыми перчатками) . 'Сначала суспензия внезапно становится более вязкой, но затем при дальнейшем нагревании вязкость снова падает и суспензия превращается в прозрачный золь. На этой стадии золь быстро дегазируют под вакуумом и переливают в лоток. Через 5—10 мин образуется гель.
Если требуется приготовить гель, содержащий мочевину в высокой концентрации, нагревание лучше проводить не на газовой горелке, а в водяной бане при 70°С. Спустя 10—15 мин, в течение которых суспензию нужно несколько раз энергично перемешать, она становится очень вязкой, а еще через 10 мин нагрева превращается в прозрачный золь. Прокоп и Уленбрук [1037] предложили иную методику получения геля. Буфер разделяют на две части. В одном стакане, содержащем 1/4 необходимого объема буфера, суспендируют крахмал, а остальную часть (3Д) буфера в другом стакане доводят до кипения. Стакан снимают с огня и в горячий буфер при энергичном перемешивании вливают суспензию крахмала. Перемешивание продолжают до тех пор, пока образовавшаяся кашица не превратится в прозрачный золь, который выливают в лоток. Недостаток этого метода заключается в том, что при его использовании трудно провести дегазацию. Образование больших пузырей можно предотвратить, если при перемешивании соблюдать осторожность. Описанную методику нельзя использовать для приготовления гелей, содержащих мочевину.
ПРИБОРЫ
Приборы для горизонтального электрофореза. Согласно первому сообщению Смитиса [1199], гель помещали в пластмассовый лоток шириной 25 см, длиной 25 см и глубиной 0,65 см. Тонкое дно толщиной 1,5 мм давало возможность обеспечить хорошее отведение тепла. Впоследствии было описано много модификаций такого лотка. Например, Бодман [143] предложил конструкцию, позволяющую после электрофореза в том же лотке разрезать гель на сегменты. Контакт между гелем и буфером обычно осуществлялся при помощи фитилей из ткани или фильтровальной бумаги. Кроме того, в дне лотка можно прорезать шели, расположив их перпендикулярно направлению электрофореза, и установить электрический контакт с гелем че-
Рис. 25. Часть пластмассового лотка, используемого при вертикальном электрофорезе в крахмальном геле, и крышка с приспособлением для формирования щелей ([1200], с изменениями).
рез губки, вложенные в эти щели (лучше всего использовать губки из вискозы).
