Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
В лаборатории Лаурелла был разработан метод электрофореза в агарозном геле для разделения белков. Подробное описание прибора и методики можно найти в работе Иоханссона [630]. Электрофорез проводят в 1%-ном геле толщиной 1 мм на охлаждаемой водой стеклянной пластинке. Для охлаждения используют пластмассовую коробку с циркулирующей в ней водой (температура не выше 15 °С). Электрический контакт между разделяющим гелем и сосудами с буфером осуществляется через агарозные мостики. Канавки в геле для внесения 3— 10 мкл пробы, содержащей 10—100 мкг белка, получают при помощи сделанного из стальной бритвы шаблона с прямоугольными зубцами. Его помещают на пластинку сразу же, как только выливают на нее теплый раствор агарозы. Градиент напряжения при электрофорезе составляет 15—20 В/ом.
Электрофорез в агаровом или агарозном гелях можно проводить также в маленьких стеклянных трубочках аналогично диск-электрофорезу ib полиакриламидных гелях. Чтобы при этом гели не выскальзывали из трубочек, нижнюю часть их закрывают нейлоновой сеткой [286, 533, 534],
Фиксация белков в агаровых (агарозных) гелях. Гели на
15 мин помещают в раствор, содержащий насыщенную пикриновую кислоту и 20%-ную уксусную кислоту в отношении 3: 1
[278]. Полосы белков полностью проявляются через 1—2 мин и остаются четкими и после высушивания геля.
Высушивание геля. Пластинку накрывают листом хроматографической бумаги и помещают в термостат при 37°С. Спустя
16 ч гель высыхает и превращается в тонкую однородную пленку, плотно прилегающую к стеклянной пластинке. После этого гель можно окрасить. Вообще, рекомендуется всегда, когда это возможно,'окрашивать агаровый гель после его высушивания. Обесцвечивание проводят в растворе, содержащем 2% уксусной кислоты и 15% глицерина в воде, после чего гель вновь высушивают, как описано выше [1419]. Глицерин необходим для облегчения последующего отделения пленки от стеклянной пластинки.
Гель можно также высушить феном в струе теплого воздуха. Иоханссон [630] применяет следующую методику: после фиксации в пикриновой кислоте пластинку промывают в течение 2—3 мин в 95%-ном этаноле, а затем аккуратно накрывают влажной фильтровальной бумагой ватман № 1 или шлейхер-шюлль 2043Ьтак, чтобы между гелем и'бумагой не осталось пузырьков воздуха. Для ускорения высушивания поверх бумаги кладут мягкую целлюлозную тиань толщиной 1 см и прижимают ее пластинкой, на которую помещают груз массой 2 кг. Уже через 10 мин гель превращается в очень тонкую пленку, которую можно быстро досушить струей теплого воздуха, не снимая с геля фильтровальной бумаги.
МИКРОЭЛЕКТРОФОРЕЗ В АГАРОВОМ (АГАРОЗНОМ) ГЕЛЕ
В 1957 г. был описан метод исследования образцов объемом 1 мкл и меньше, содержащих 1—2% белка [1421]. Позднее он был модифицировав [1418, 1419]: применение высокоэффективного охлаждения позволило использовать более высокие градиенты напряжения и благодаря этому значительно улучшить разделение.
Агаровые пластинки готовят по методу Грабара и Уильямса [461]. Предметные стекла (76X25X0.9 м'м) помещают на поверхность застывшего агара в чашке Петри и заливают расплавленным раствором агара так, чтобы он покрыл и предметные стекла, и 'свободную поверхность поддерживающего геля слоем толщиной 1,7 мм. После застывания геля стекла вырезают скальпелем или бритвой. Канавки делают либо узким кусочком безопасной бритвы, либо лолоокой плотной фильтровальной бумаги шириной 4 мм. Канавки, вырезанные кусочком бритвы, следует промокнуть полоской фильтровальной бумаги, длина которой определяется количеством удаляемой жидкости. После нанесения микропипеткой пробы (обычно 1 мкл или
------ ----- ---:: ~
\
Рис. 23. Схематическое изображение камеры для электрофореза [1419]. / — система трубок с множеством мелких отверстий для продувания воздуха через охлаждающую среду; 2 — металлическая коробка, заполненная льдом, для. конденсации паров петролейного эфира; 3 — платиновые проводники для измерения электрического потенциала по краям используемых для электрофореза предметных стекол.
меньше) стекло кладут гелем вниз на блок агарового геля (рис. 23). Прибор, показанный на рис. 23, специально изготовлен для этого метода, но можно пользоваться и более простой коробкой, описанной в работе Виме [1419]. Температуру в процессе электрофореза регулируют при помощи петролейного эфира, помещенного в центральную часть электрофоретического 'сосуда. (Петролейный эфир легко воспламеняется, поэтому должны быть приняты меры предосторожности, полностью исключающие образование искр.) После заполнения электродных сосудов буферным раствором центральную камеру закрывают стеклянной крышкой и начинают электрофорез при напряженности поля около 25 В/см.
Высушенные и окрашенные пленки можно покрыть разбавленным раствором канадского бальзама, при этом толуол быстро испаряется и препараты становятся пригодными для сканирования или хранения [1419].
