Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Различия между белками с одинаковыми или разными зарядами и(или) размерами. Хедрик и Смит [538] подробно исследовали белки методом электрофореза в полиакриламидном геле и пришли к заключению, что график Фергюсона дает важные сведения о заряде и размерах белковых молекул. Если на этом графике прямые для разных белков параллельны, т. е. значения ?/0-различны, а значения К? равны, то белки имеют одинаковые молекулярные массы, но различаются по заряду (рис. 34). С другой стороны, если значения U& одинаковы, а значения Кт разные, то белки характеризуются одним и тем же зарядом, но разными молекулярными массами (рис. 35). Такие молекулы могут быть полимерами или олигомерами, состоящими из разного числа идентичных субъединиц. Если же прямые пересекаются (рис. 36, А), т. е. обе величины ?/0 и Кт различны, то, значит, и
Рис. 33. Зависимость длины отрезков, отсекаемых графиками Фергюсона для разных белков на оси ординат U0, от количества агента, образующего поперечные сшивки в полиакриламидных гелях [1Ю9]. Д фибриноген; ф липопротеид с низкой плотностью; Ў фикоэритрин; ? гемоглобин А; О бычий сывороточный альбумин.
Рис. 34. Влияние концентрации геля на подвижность изоферментов лактатде-гидрогеназы (ЛДГ). Видно, что изображенные на рисунке прямые имеют отрицательный наклон [538].
заряд, и размеры исследуемых белков также различны. В этом случае графическим методом, описанным Родбардом и др. [1107], можно определить ту концентрацию геля, при которой достигается наилучшее разделение (Гтах) или оптимальное разрешение (ropt). Построив график Фергюсона для двух изучаемых белков (рис. 36,?), проводят биссектрису угла между полученными прямыми (штриховая прямая на рис. 36, Б). Величину подвижности в точке пересечения прямых для белков U умножают на 0,386 (1/е, где е — основание натуральных ло-
Рис. 35. Влияние концентрации геля на подвижность полимеров бычьего сывороточного альбумина [538]. Видно, что изображенные на рисунке прямые имеют отрицательный наклон.
Концентрация геля, %
Рис. 36. А. Влияние концентрации геля на подвижность мономера ферритина и яичного трансферрина [538]. Видно, что изображенные на рисунке прямые имеют отрицательный наклон. Б. Графический метод определения величин
Т'шах И Гор. [1107].
гарифмов). Полученную величину находят на оси ординат и от нее проводят горизонтальную прямую до пересечения со штриховой прямой. Концентрация геля, соответствующая точке их пересечения, дает величину Тшах. На'илучшее разделение — это то, при котором середины зон двух белков достаточно далеко
отстоят друг от друга. Однако при Гтах возможна высокая диффузия разделенных зон. Если концентрацию мономеров увеличить еще больше, то разделение белков ухудшится, но одновременно снизится и диффузия. Следовательно, можно найти та-кую концентрацию геля Горь при которой разрешение будет максимальным. Для определения величины Горt проводят горизонтальную прямую на высоте 0,135 U (U/e2) и на оси абсцисс* находят концентрацию геля, соответствующую точке пересечения горизонтальной прямой со штриховой. Подробности и математические выкладки можно найти в работе Родбарда и др.
[1107].
Результаты, полученные из анализа графика Фергюсона, позволяют выбрать наиболее перспективный метод для разделения компонентов данной смеси. Если мы имеем дело с изомерами, имеющими одинаковые размеры, то следует применять, методы разделения по заряду, например электрофорез или ионообменную хроматографию. Если же молекулы различаются* по размеру, но не по заряду, то целесообразно использовать гель-фильтрацию или препаративный электрофорез в полиакриламидном геле, основанные на эффекте молекулярного сита. Метод анализа соотношений размер — заряд у белков был распространен также и на случаи связывания ими лигандов [539].
Как отмечено выше, при электрофорезе в полиакриламидном геле компоненты разделяются одновременно и по размеру, и по заряду. Даже если препарат обнаруживает в полиакриламидном геле только одну полосу, это вовсе не исключает возможности того, что он содержит более одного компонента. Например, крупная молекула с большим зарядом будет' двигаться с такой же скоростью, как и слабо заряженная молекула малых размеров. В результате получится лишь одна полоса. Поэтому для проверки чистоты препарата его необходимо исследовать при нескольких концентрациях геля и различных условиях проведения опыта (разных значениях pH).
ДИСК-ЭЛЕКТРОФОРЕЗ
Это название [942] происходит от двух английских слов — discontinuity, обозначающего в данном контексте неоднородность электрофоретической среды, и discoid — дискообразный. Дело в том, что по случайному совпадению при стандартных условиях проведения опыта разделенные зоны ионов имеют-форму дисков.
Для диск-электрофореза характерны скачкообразные изменения pH, концентрации геля и градиента напряжения. Схема диск-электрофореза показана на рис. 37. Нижняя часть трубки заполнена разделяющим гелем с порами, которые действуют” как молекулярное сито по отношению к изучаемым макромо--
