Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Преимущества и недостатки неоднородных буферных си-хтем. Основное преимущество диск-электрофореза заключается в концентрировании разделяемых веществ с образованием очень узких зон. Недостатком является то, что в процессе изо-тахофореза белки могут достигать такой высокой концентрации, что это вызывает их осаждение. Кроме того, некоторые
* белки нестабильны в зоне pH, используемой для их 'исследования методом диск-электрофореза.
Кроме изотахофореза существуют и другие способы концентрирования исследуемой пробы. Было предложено [570], например, применять для этой цели высокий градиент напряжения. Если пробу, содержащую макромолекулы, отдиализовать против разбавленного буфера, а затем наслоить ее поверх разделяющего геля, содержащего тот же буфер, но в более высо-
рНЯО
(25°СУ
Начальные
концентрации^
Гель Трис
8% 0,075
4,5% 0,375Ш
6% 0,375М{
0375Н
Верхний гель
Замыкающий ион Катод fi 1
ФазаУ' ,
ш)
Анод
Ут
Ш
I I Замыкающий ион {?:•¦'] Ведущий ион [Щ Бепок Сахароза
1Л
1
ю
о”
+*
з;
си
<1
I
Рис. 38. Электрофорез в полиакриламидном геле со ступенчатым градиентом
напряжения [21].
кой концентрации, то после наложения электрического поля в зоне нанесенной пробы образуется более высокий градиент напряжения, чем в остальных участках геля, в результате чего* белки начинают двигаться с относительно 'высокой скоростью^ У поверхности разделяющего геля движение белков замедляется, потому что, во-первых, в разделяющем геле градиент напряжения 'падает и, во-вторых, в нем начинает проявляться эффект молекулярного сита. Однако концентрирующий эффект такого метода, безусловно, не столь велик, как в случае изо-тахофореза. Кроме того, при низкой ионной силе отдельные белки могут образовывать агрегаты.
Аллен и др. [21] использовали градиент напряжения и движущуюся границу для концентрирования пробы перед ее разделением. В этой системе pH везде одинаков и лишь в гелег содержащем пробу, снижена концентрация буферных ионов. Замыкающий ион, находящийся сначала в электродном сосуде, имеет более высокую подвижность, чем любой белковый ком-
понент. В течение первой фазы белки концентрируются под действием высокого градиента напряжения и входят в разделяющий гель. После того как замыкающий ион перегонит белковые полосы, возникает вторичный эффект концентрирования, обусловленный скачком проводимости (фаза 2 на рис. 38).
Разработано много систем, в которых либо не требуется предварительного концентрирования компонентов пробы, либо его невозможно провести до фракционирования в разделяющем геле. В таких системах концентрирующий и стартовый гели вообще отсутствуют, а исследуемый образец, содержащийся обычно в растворе сахарозы более высокой плотности, чем электродный буфер, наслаивают непосредственно на поверхность разделяющего геля.
ПОЛИАКРИЛАМИДНО-АГАРОЗНЫЕ СОСТАВНЫЕ ГЕЛИ
С тех пор как полиакриламидно-агарозные составные гели были предложены [984, 1324] в качестве поддерживающей среды при исследовании полимеров с очень высокой молекулярной массой, эти гели часто используются при изучении нуклеиновых кислот и нуклеопротеидных частиц. Разделение в них также зависит от размеров и заряда макромолекул. При этом агароза лишь улучшает механические свойства разбавленного полиакриламидного геля и не влияет существенно на свойственный ему эффект молекулярного сита.
Таблица 1
Физические свойства компонентов полиакриламидных гелей [839]
Свойства Акриламид Бис-акриламид ТЕМЭД
Молекулярная 71,08 154,16 116,20
масса
Внешний вид Белое кристалли Белое кристалли Желтое масло
ческое вещество ческое вещество
Запах --- --- Аммиачный
Растворимость, 2,0 (Н20) 0,3 (Н20) Смешивается с во
г/мл при 30 °С 1,1 (метанол) дой и органиче
0,4 (ацетон) скими раство
0,4 (хлороформ) рителями
Температура плав 84,5±0,3 185 (с полимери 120---122
ления или тем зацией)
пература кипе
ния, °С
Плотность 1,122 (D430) --- 0,777 (D420)
Показатель пре --- --- 1,4184 ±0,0005
ломления, п420
1.11.2. Физико-химические свойства составных частей геля
Физические свойства акриламида, быс-акр-иламида и ТЕМЭД представлены в табл. 1.
Акриламнд в кислой или щелочной среде гидролизуется до акриловой кислоты. При взаимодействии его с соединениями, содержащими гидроксильные группы, образуются р-арилгидр-окси- или алкгидро-ксипропионамиды. Реакция акриламида с аммиаком приводит к образованию р-р'-р"-нитрилоп)ропион-амвда, а реакция с меркаптанами — к образованию {5-алкил-меркаптопропионамидов. Наиболее важная реакция между ак-риламидом и б«с-акриламидом — это полимеризация, которую-можно инициировать естественным светом, 7~°блучением или ультразвуком. В связи с этим исходные растворы необходима хранить в темноте и на холоду (4°С).
