Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Персульфат аммония (NH^SjOe очень неустойчив в воде, поэтому для приготовления геля необходимо использовать лишь овежегтриготовленные растворы этого реактива. Его можно заменить более стабильным персульфатом калия (K2S2O8), который, однако, имеет низкую растворимость при 4°С. Насыщенный раствор K2S2O8 (при 4°С) можно с успехом применять вместо неустойчивого персульфата аммония. Оставаясь в геле, персульфат может окислять исследуемые белки и приводить тем самым к артефактам. Для его выявления гель погружают в 2%-ный раствор бензидина в 10%-ной уксусной кислоте [108]. При концентрации персульфата выше 8—14 мкг/мл развивается синяя окраска, зависящая от использованного буфера.
Токсичность акриламида. Акриламид токсичен даже в разбавленных растворах (около 1%), поэтому следует остерегаться попадания его на кожу и ©дыхания распыленных частиц.
1.11.3. Аналитический электрофорез в полиакриламидных гелях
ПРИБОР И ВСПОМОГАТЕЛЬНЫЕ ПРИСПОСОБЛЕНИЯ
Прибор для аналитического диск-электрофореза состоит в основном из верхнего и нижнего сосудов, в которые помещают электроды, изготовленные из платиновой проволоки (или иног» да из угольных стержней). Трубки, содержащие 'столбики геля.
располагаются вертикально между этими двумя электродными сосудами (рис. 39). В дне верхнего сосуда просверлены отверстия, в которые вставляют либо уплотнительные кольца из силиконовой резины, либо резиновые пробки с отверстиями, либо нейлоновые прокладки [541]. В эти уплотнители в свою очередь вставляют верхние части трубок с гелем таким образом, чтобы буфер из электродного сосуда нигде не мог просочиться. Неиспользованные отверстия так же плотно затыкают резиновыми пробками. Чтобы градиент напряжения между электродами и всеми гелями был одинаков, центры трубок с гелем должны располагаться на одном и том же расстоянии от электродов; расстояния между трубками также должны быть одинаковыми. В литературе описано много конструкций приборов для диск-электрофореза [115, 227, 835], но все они являются модификациями устройства, предложенного ранее Дэвисом [281].
К дополнительному оборудованию, необходимому для приготовления и последующей обработки гелей, относятся микропипетки, шприцы, подставки, в которые устанавливают трубки для их заполнения, и лампа для полимеризации геля. Для проведения электрофореза нужны источник питания, соединительные провода и вольтметр.
Аналитический диск-электрофорез в трубках проводят по существу так, как его описал Дэвис [281]. Обычно применяют стеклянные трубки, но некоторые авторы предпочитают трубки из плексигласа или поликарбоната. Внутренний диаметр трубок равен около 5 мм, а наружный 7 мм; длина трубки составляет 65—70 мм. Внутренний диаметр должен быть постоянным по всей длине трубки, а ее края — идеально гладкими, так как иначе гель может быть поврежден при его извлечении из трубки. Острые края рекомендуется отшлифовать при помощи точила или наждачной бумаги. Ни в коем случае их нельзя оплавлять на стеклодувной горелке. Если разделяемые вещества характеризуются весьма близкими электрофоретическими подвижностями, целесообразно использовать более длинные трубки [962, 963]; однако следует помнить, что при этом увеличивается время разделения, а следовательно, получаются размытые зоны, которые трудно оценивать количественно.
Стеклянные трубки перед употреблением тщательно очищают, помещая их на несколько часов в хромовую смесь. Затем их отмывают водой и высушивают, после чего окунают в ацетон и вновь высушивают в токе воздуха или в сушильном шкафу.
Для предотвращения эндосмотического тока рекомендуется покрывать трубки мстилцеллюлозой [565].
Перед заполнением трубки раствором один ее коней либо закрывают резиновым колпачком [281], либо плотно прижимают к поверхности губчатой .-резины* покрытой пленкой из пара-
Рис. 39. Схема прибора для аналитического электрофореза в полиакриламидном геле (фирма Shandon Southern). )—электрический провод; 2 —электрод, вмонтированный в крышку; 3 — верхний электродный сосуд; 4 — уплотнительное кольцо для трубки; 5 — калиброванные трубки для геля; 6 — электрический провод; 7 — узел нижнего электрода; 8— верхний электродный сосуд из комплекта для изоэле^трического фокусирования; 9 — вкладыш из комплекта для изоэлектрического фокусирования; 10 — нижний электродный сосуд.
фильма, либо заклеивают липкой лентой [904]. Мы в течение ряда лет с успехом применяем следующий метод. Торец трубки прижимают к липкой ленте и аккуратно обрезают ее вокруг трубки, которую затем обмакивают этим концом в расплавленный парафин на глубину 5 мм. Трубки с закрытыми нижними отверстиями устанавливают строго вертикально [42].
Вместо цилиндрических столбиков можно применять щрямо-угольные гели (полоски), которые легче фотографировать и денситометрировать, так как при этом устраняются оптические
искажения, связанные с цилиндрической формой объекта [20, 53, 904]. С другой стороны, в столбиках гелей создаются более равномерные температурные градиенты, чем в полосках, что позволяет прикладывать более высокие градиенты напряжения [281].
