Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
1.11. Электрофорез
в полиакриламидном геле
1.11.1. Теория электрофореза в полиакриламидном геле
После первого применения полиакриламидного геля в качестве поддерживающей среды для электрофореза [1065] и особенно после опубликования основополагающих работ Орнштейна [942] и Дэвиса [281] электрофорез в полиакриламидном геле стал одним из наиболее широко используемых в биохимии методов. Его высокая разрешающая способность позволяет не только разделять смеси, содержащие большое число разных видов макромолекул, но и характеризовать их по заряду, молекулярной массе и конформации. Будучи инертной поддерживающей средой, полиакриламидный гель очень часто используется при исследовании макромолекул методами изоэлектри-ческого фокусирования и изотахофореза.
ОБРАЗОВАНИЕ СТРУКТУРЫ ГЕЛЯ
Для получения полиакриламидного геля используют акриламид и какой-либо агент, образующий поперечные сшивки, — обычно Ы,Ы'-метиленбисакриламид (сокращенно бис-акриламид). Реакцию проводят в присутствии катализаторов и инициаторов. В ходе ее происходит винильная полимеризация (рис. 28), приводящая к формированию геля с хаотически свернутой структурой.
Для характеристики полиакриламидного геля необходимо указывать процентное содержание мономеров (Г=Акриламид + 4-Мономер, образующий поперечные сшивки) и количество сшивающего агента в процентах от общего количества мономеров (С) [562]:
Г=-^-.100(%)
с=~гт<г-|00<%>'
где а — количество акриламида, г; Ъ — количество мономера, образующего поперечные сшивки, г; т — объем буфера, мл.
Соотношение между сшивающим агентом и акриламидом весьма важно, так как оно существенно влияет на механические
СН2=СН СН2=СН — СН2—СН — СН2 — СН — СН2 — СН
с=о +
с=о
с=о
с=о
NH
nh2
NH,
NH
СН
СН2
NHa NH * NH
NH
CH, = CH
c=o
CH2(CHOH),—CHjOH
NvC^C=0+(CH3)2—n—ch—ch2— n—(CH3)2 nACxNH
11
+ hv О
Рис. 28. Реакция полимеризации акриламида с бис-акриламидом [229]. Инициаторами (0 служат персульфат, рибофлавин н свет (Av), а катализатором —
ТЕМЭД.
и физические свойства геля. Дэвис [281] исследовал гели, содержавшие от 1,5 до 60% акриламида и от 0 до 0,625% бис-акриламида, и установил, что при получении гелей для электрофореза необходимо соблюдать следующее правило: чем выше концентрация акриламида, тем ниже должна быть концентрация б^оакриламида, и наоборот. Одновременное увеличение содержания обоих компонентов приводит к образованию гелей с повышенной жесткостью и хрупкостью, а одновременное снижение— к возрастанию мягкости и эластичности. В общем случае для гелей с концентрацией 5—15% Т рекомендуется выбирать С в пределах 2—4%.
Для расчета оптимального количества б^с-акриламида было предложено несколько эмпирических формул. Так, Ричардс и др. [1987] вывели уравнение
которое обеспечивает получение приемлемых гелей, содержащих 5—20% Т. При разделении сывороточных белков [159] была использована формула
С=6,5— 0,37\
(о
в = 0,201 — 0,01127\
где В — концентрация бнс-акриламида (масса/объем).
Блэттлер и др, [131] высказали мысль, что в процессе полимеризации б«с-акриламид действует как терминатор цеп'и и что при более высоких концентрациях он уменьшает максимальный размер пор геля. Приемлемые гели в диапазоне концентраций 2—40% Т можно получить, по мнению этих авторов, пользуясь формулой
Константа
^-акриламид, мгвд__г, (3)
где константа равна 1300, а количества акриламида и бис-ак-риламида даны соответственно в граммах и миллиграммах на 100 мл геля.
Родбард и др. [1109] пришли к заключению, что гели с большим числом поперечных сшивок имеют более крупные поры, чем гели, содержащие малые количества сшивающего агента. Поэтому первые можно использовать в тех электрофоретических методах, в которых эффект молекулярного сита полиакриламидного геля нежелателен, например при изоэлектриче-ском фокусировании или изотахофорезе.
Изучение строения полиакриламидных гелей с помощью сканирующего электронного микроскопа [1119] показало, что ячеистая структура геля становится различимой при концентрациях 4% Г и 0,2—5% С. Повышение содержания мономера сопровождается увеличением количества структурированной массы на единицу площади и возрастанием толщины мембран геля. В отсутствие агента, образующего поперечные сшивки, в геле обнаруживаются длинные тонкие волокна, расположенные только в продольном направлении. При содержании С выше 5% структурная организация становится менее выраженной, а примерно при 10% С на микрофотографиях появляются изображения структур, похожих на луковицы и, возможно, соответствующих кластерам, о существовании которых высказали предположение Родбард и др. [1109].
