Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
„Начало
? Глицин УТЛ Хлорид
я t Глициновый
J \ ффер
------{исходный объем
про&ы
Концентрирующий гель
Мелкопориарый 'гель
—V\ Глициновый _J joypep х
крупнопористая прртивй' конвекционная среда
Рис. 37. Диск-электрофорез [942]. А. Начало электрофореза. Б. Белки в концентрирующем геле. В. Белки в процессе разделения.
лекулам. Над разделяющим гелем находится концентрирующий гель, имеющий крупные поры и поэтому не обладающий свойствами молекулярного сита, а еще выше располагается стартовый гель, содержащий пробу и краситель, используемый в качестве свидетеля. Стартовый гель имеет такой же состав, что и концентрирующий гель. Буфер, заполняющий электродные сосуды, содержит ион, подвижность которого должна быть наименьшей при pH концентрирующего и стартового гелей. Значения pH в данной системе играют очень важную роль и должны выбираться с учетом следующих требований.
1. В концентрирующем и стартовом гелях белки должны концентрироваться в результате изотахофореза [942]. При тех значениях pH, которые имеют эти гели, буферный (замыкающий) ион, находящийся в электродных сосудах, должен иметь наименьшую электрофоретическую подвижность.
2. Разделяющий гель должен иметь такой pH, чтобы под-движ'ность замыкающего иона в нем была выше, чем подвижность любого другого компонента пробы. В этом случае замыкающий ион будет двигаться впереди белкоБ.
Если указанные выше условия выполнены, то белки попадают в однородную электрофоретическую среду, где они разделяются в соответствии с их размером и зарядом.
В качестве примера неоднородной системы приведем здесь схему, описанную Орнштейном [942] и Дэвисом [281]. Поскольку подвижности сывороточных белков при pH 8,0 лежат в пределах 0,6* 10~5—8-10~5 см2-В-1-с-1, желательно, чтобы подвижность замыкающего иона была ниже 0,6* 10-5 см2-В_1-
• с-1. Подвижность иона глицината в свободном растворе равна — 15 единицам подвижности (1 единица подвижности соответствует 10“5 см2-В-1-с-1). Чтобы в буфере подвижность этого иона составила —0,6 единицы, степень ионизации глицина не должна превышать 7зо. Согласно уравнению Гендерсона — Гассельбаха, такая степень ионизации получается при pH 8,3. Хорошей буферной емкостью при этом pH обладает трис. Ведущим ионом является С'1“ В процессе изотахофореза белки концентрируются и входят в разделяющий гель, где скорость их движения замедляется вследствие эффекта молекулярного* сита. С другой стороны, из-за изменения pH при входе в разделяющий гель (pH 9,5) подвижность глицината становится равной 5 единицам, в результате чего этот ион перегоняет все’ сывороточные белки. (Движение глицината не тормозится гелем, поэтому для того, чтобы он достиг более высокой скорости, чем любой компонент белковой смеси, даже и не требуется изменения pH.)
При подборе системы для диск-электрофореза следует руководствоваться правилами, выработанными Уильямсом и1 Рейсфелдом [1423].
Система анионов. 1. Необходимо отметить, что если pH разделяющего геля выбран в соответствии с указанными требованиями, то во время электрофореза он будет примерно на 0,5 единицы pH выше, чем в исходном геле.
2. В качестве ведущего иона наиболее подходящим является С!-, так как он обладает высокой подвижностью и совместим практически с любым белком.
3. Значение pH концентрирующего и стартового гелей должно быть на 2—3 единицы pH ниже, чем р/Са замыкающего иона.
4. Замыкающим ионом должна служить слабая кислота или аминокислота, имеющая р/(а примерно на одну единицу выше,, чем pH разделяющего геля.
5. Для приготовления разделяющего геля удобно использовать основание, имеющее р/Са 'приблизительно 'на одну единицу* ниже, чем его pH. Это обеспечивает высокую буферную емкость разделяющего геля. (Концентрирующий \И стартовый гели мож'но готовить вообще без применения буферных растворов.)
6. Значение pH электродного буфера следует подогнать к величине р/Са буфера в разделяющем геле.
Система катионов. 1. Во время электрофореза pH разделя-
ющего геля должен снизиться примерно на 0,5 единицы pH по сравнению с его исходным значением.
2. В качестве ведущего иона рекомендуется использовать К+.
3. Замыкающим ионом должно служить слабое основание или аминокислота, у которых величина р/(а примерно на одну единицу ниже, чем pH разделяющего геля.
4. Значение pH концентрирующего и стартового гелей должно быть на 2—3 единицы pH выше, чем р/Са замыкающего иона.
5. Величина р/Са буфера, используемого для приготовления разделяющего геля, должна быть примерно на одну единицу выше, чем pH разделяющего геля.
6. Значение pH электродного буфера следует подогнать к величине р/Са буфера в разделяющем геле.
К настоящему времени уже описана во всех деталях целая -серия неоднородных буферных систем, позволяющих исследовать методом диск-электрофореза все типы белков [645—647].
За эффектом концентрирования удобно наблюдать при помощи соответствующего красителя. Если он сконцентрировался в узкую полосу, то она остается такой же узкой на протяжении всего разделения. Если же концентрирования не произошло, то зона красителя будет расплывчатой. Искажения в значениях pH можно обнаружить, разрезав гель на части и измерив pH этих частей. Используют также химические методы анализа. Например, с помощью 0,1 М хлорида бария выявляют сульфат или ДСН, бензидин применяют для определения персульфата, а ацетат лантана (1%-ный раствор в 7%-ной уксусной кислоте)—для определения фосфата. Флуорескамин может служить для выявления первичных аминов, и даже радиоактивные компоненты буфера находят себе применение [232]. Положение белков устанавливают -путем их окрашивания.
