Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Для нанесения проб в геле делают скальпелем вертикальные надрезы и помещают в них прямоугольные кусочки фильтровальной бумаги, предварительно пропитанные исследуемым раствором. Бумажки должны стоять вертикально и не выступать над поверхностью геля. После завершения электрофореза их аккуратно вынимают пинцетом. Пробу можно вносить также в виде кашицы, приготовленной из гранулированного крахмала. В этом случае нужно сделать щель большего размера, для чего удобно воспользоваться приспособлением, изготовленным из двух безопасных бритв. После нанесения пробы поверхность геля накрывают какой-либо пленкой, например из парафильма, или пластмассовой крышкой из перспекса, покрытой тонким слоем минерального масла.
Приборы для вертикального электрофореза. Вертикальный электрофорез более трудоемок, чем горизонтальный, но обладает значительными преимуществами [449, 1200]. При горизонтальном электрофорезе в крахмальном геле электродекантация раствора белка, внесенного в канавку, может привести к искажению формы полос, что исключено в случае вертикального электрофореза. Кроме того, при использовании вертикального прибора теплоотдача идет с одинаковой скоростью с обеих поверхностей геля, а это позволяет применять более высокие градиенты напряжения, \в результате чего разделение улучшается. Охлаждение геля при помощи рубашек дает возможность еще больше повысить градиент напряжения.
Гель приготавливают в пластмассовом лотке со съемными передней и задней стенками (рис. 25). Крышка из того же ма-
териала сделана таким образом, что в нее можно вставлять устройство для формирования щелей. Когда лоток заполнен горячим дегазированным золем крахмала, крышку быстро устанавливают на место. Рекомендуется ее предварительно нагреть до 70 °С, чтобы избежать образования пузырьков воздуха в геле. Углы крышки прижимают чем-(нибудь тяжелым и оставляют в таком, положении до тех пор, пока гель не остынет. Снимать крышку нужно осторожно, чтобы .не повредить щели. Пробы втюсят капиллярной пипеткой. Узкие перемычки геля между щелями, которые образуются, если в крышку вставлены зубья циркульной пилы, препятствуют перемешиванию проб в соседних щелях. Гордон [449] предпочитает обходиться без пилы, но при отсутствии перемычек исследуемые образцы следует вносить более осторожно. Чтобы закрыть пробы, поверх них наливают нагретый примерно до 45°С вазелин. Затем расплавленным вазелином покрывают всю остальную свободную поверхность геля. Из лотка убирают переднюю и заднюю стенки и устанавливают его в вертикальное положение (рис. 26). Важно, чтобы щели для проб были тщательно выравнены в обеих плоскостях. Если их положение окажется не абсолютно горизонтальным, то пробы не войдут в гель равномерно по всей плоскости. Смитис [1200] предложил использовать обратимые электроды Ag/AgCl (без выделения газа на аноде). При вертикальном расположении прибора пробы могут перемещаться либо вверх, либо вниз, но перемещение вниз обычно имеет преимущество.
ОБРАБОТКА ГЕЛЕЙ ПОСЛЕ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА
После электрофореза крахмальный гель необходимо разрезать вдоль, так как краситель не проникает в целую пластину. Уникальное преимущество крахмального геля состоит именно в том, что его относительно легко разрезать на узкие полосы. Это дает возможность одновременно определять в одном опыте различные ферментативные ак*
Рис. 26. Прибор для йертикалъного электрофореза в крахмальном геле. ([1200] с изменениями). 1 — положение щели для пробы; 2 — крахмальный гель; 3 — слой вазелина.
Рис. 27. Приспособление для разрезания крахмального геля на продольные
полосы.
тивности и служит одной из причин того, что исследователи, работающие с множественными молекулярными формами ферментов предпочитают использовать крахмальный гель в качестве среды для электрофореза. По окончании электрофореза гель переносят в специальный лоток для разрезания (рис. 27). При этом необходимо, чтобы верхняя поверхность геля была обращена вниз, а щели для проб были расположены с противоположной стороны от «ограничительного блока» лотка. Разрезают гель лезвием дерматома [1200] или тонкой стальной проволокой. Если гель нужно разрезать на множество узких полосок, то для этого можно использовать специальный лоток, состоящий из ряда уложенных друг на друга рамок. Снимая их одну за другой, отрезают от геля выступающую над краем следующую полоску. Обычно рекомендуется самую верхнюю полоску отбросить, особенно в случае горизонтального электрофб-реза. Если электрофорез проводится в очень тонком слое геля, то его можно не разрезать [266,578]. Гель окрашивают на белок или ферментативную активность (методики см. гл. 1.15 и II.5). Не все красители, предназначенные для окрашивания белков, пригодны для крахмального геля. В большинстве работ использовали амидовый черный 10 В или нигрозин.
МИКРОЭЛЕКТРОФОРЕЗ В КРАХМАЛЬНОМ ГЕЛЕ
Остроумную микромодификацию электрофореза в крахмальном геле описал Даамс [266]. Тонкий слой геля, нанесенный на нижнюю поверхность покровного стекла, соединяется с двумя блоками из агара. Центральная камера прибора заполняется пентаном, испарение которого под действием тока воздуха, создаваемого водоструйным насосом, обеспечивает очень эффективное охлаждение. В этих условиях даже при использовании градиента напряжения 85 В/см температура не поднимается выше 10 °С. Для оптимального разделения веществ с помощью микроэлектрофореза необходимо применять более высокую по сравнению с макрометодами концентрацию крахмального геля.
