Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Гааль Э. -> "Электрофорез в разделении биологических макромолекул" -> 22

Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.

Гааль Э., Медьеши Г., Верецкеи Л. Электрофорез в разделении биологических макромолекул — М.: Мир, 1982. — 448 c.
Скачать (прямая ссылка): elektroforezvrazdeleniibiologicheskih1982.djvu
Предыдущая << 1 .. 16 17 18 19 20 21 < 22 > 23 24 25 26 27 28 .. 185 >> Следующая

1.9.3. Препаративный электрофорез в агаровом и агарозном гелях
Прекрасные результаты, полученные при электрофорезе в ага-ровом геле, поставили на очередь вопрос о применении его в-препаративных целях. Рэйтер [1080] использовал колонку с агаровым гелем для разделения сывороточных белков в количествах до 1 г. По окончании электрофореза колонкуk разбирали и после визуализации зон вырезали сегменты геля, содержащие белковые фракции. Зоны, однако, оказались искривленными из-за недостаточного рассеяния тепла.
5-2295
Колонки для препаративного электрофореза в полиакриламидном геле используют также и для электрофореза в агаровом геле [1390, 1439].
Препаративное электрофоретическое разделение веществ можно проводить и на пластинах геля. Но так как слой агарового геля с толщиной больше 0,5 <см невозможно достаточно эффективно охлаждать и так как при увеличении толщины геля качество, разделения ухудшается, Биме [1419] рекомендует делать длинные канавки для нанесения пробы вместо увеличения толщины пластины. После электрофореза разделенные компоненты можно обнаружить либо одним из оптических методов— сканированием или фотографированием в ультрафиолетовом свете [1076, 1077, 1307], либо окрашиванием реплики — фильтровальной бумаги, предварительно прижатой к гелю [451], либо окрашиванием небольшой полоски, отрезанной от основного геля. В последнем случае полоску геля прикладывают к соответствующей прокладке, пропитанной водным раствором алцианового синего ,[736].
Одной из наиболее сложных проблем, возникающих при проведении препаративного электрофореза, является извлечение из геля разделенных компонентов. Для этой цели можно использовать несколько способов: агаровый гель подвергают
элюции буферными растворами, центрифугированию, замораживанию и оттаиванию, обработке агаразой [1437]. Однако эта проблема до сих пор еще не решена, так как помимо самого агара в выделенные фракции могут попадать и содержащиеся в геле примеси. Наилучшие результаты были получены при использовании для элюирования фракций электрофоретического процесса [451]. Местоположение разделенных зон выявляли при помощи реплики на фильтровальной бумаге. Выделение отдельной фракции осуществляли следующим образом.
По ширине геля непосредственно перед данной фракцией вырезали канавку, заполняли ее буферным раствором, 'после чего продолжали электрофорез, заставляя белок перейти из геля в этот раствор, который каждые 2—4 мин собирали и заменяли свежим.
Проточный электрофорез в тонком слое жидкости с использованием очень разбавленного раствора агара (0,13%) [1078, 1079] так-
Рис. 24. Барьерный электрофорез [1335]. / — столбики геля; 2 —мембрана; 3 — электродные сосуды; 4 — электроды. Подробное описание см. в тексте.
же можно использовать для препаративных целей. В этом случае агар достаточно легко отделяется на небольшой центрифуге, а загрязнение фракций содержащимися в нем примесями значительно меньше, чем при работе с агаровым гелем. Препаративные модификации этого метода опубликованы в работах [945, 949, 1076].
Особой формой гель-электрофореза является барьерный электрофорез [1335] (рис. 24). Белковый раствор заливают в пространство 6 между двумя слоями геля V) и подвергают электрофорезу. При этом в результате смешивания гелей с разными величинами электроосмоса или путем введения в полиакриламидный гель дополнительных зарядов [1064] регулируют электроосмос так, чтобы он полностью компенсировал миграцию выделяемого белкового компонента. Тогда этот белок будет оставаться в пространстве 6, в то время как другие компоненты смеси переместятся сквозь гель в отсеки 5 и 7.
1.10. Электрофорез в крахмальных гелях
ПРИНЦИПЫ
Электрофорез в крахмальном геле был первым электрофоретическим методом, в котором для улучшения разделения была использована среда, обладающая свойствами молекулярного сита. Крахмал — это нерастворимый в воде полисахарид. В нативном состоянии он связывает некоторое количество воды и набухает, но не способен превратиться в жидкость при повышении температуры. Путем частичного кислотного гидролиза крахмал может быть переведен в форму, представляющую собой жидкий золь при температурах выше 70°С и твердый гидрогель при комнатной температуре. Оказалось, что для электрофореза вполне подходит картофельный крахмал [1199], но можно использовать также и рисовый [1037].
Размер пор в геле определяется концентрацией крахмала [720, 1201] и степенью его гидролиза [884]. Было показано [1201], что пройденное белком расстояние (т) при одних и тех же условиях электрофореза линейно зависит от обратной величины концентрации крахмала (s)
где а и b — константы. Из такого уравнения можно для любого белка найти коэффициент задержки при данной концентрации геля
где Ат—изменение длины пройденного пути, вызванное изменением обратной величины концентрации геля A (1/s). Коэффициент задержки может быть легко определен, так как Am/A(l/s) равно Ь, т. е. наклону прямой на графике зависимости т от 1/s. Установлено, что этот коэффициент зависит от размеров молекулы, но не зависит от ее заряда. Пористость крахмального геля в отличие от полиакриламидного варьирует лишь в довольно незначительных пределах, так как ни степень гидролиза крахмала, ни 'Концентрацию геля нельзя изменить слишком сильно без потери гелем соответствующих механических харак-
Предыдущая << 1 .. 16 17 18 19 20 21 < 22 > 23 24 25 26 27 28 .. 185 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed