Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Свойства разделяющего геля. Разделяющий гель обычно полимеризуют в присутствии персульфата. Дэвис [281] показал, что при одной и той же концентрации акриламида замена персульфата на рибофлавин приводит к увеличению размера пор в геле. Эти данные были подтверждены в подробном исследовании, проведенном позднее [310].
Скорость полимеризации акриламида можно повысить, увеличив концентрацию персульфата, однако при этом будет уменьшаться длина полимерных цепей [680].
Побочные продукты полимеризации, непрореагировавшие мономеры [230], а также персульфат могут взаимодействовать с исследуемыми веществами и приводить к искажению картины электрофореза. Особенно часто причиной артефактов служит персульфат [168, 678, 877]. Для удаления этих веществ из геля рекомендуется либо проводить предварительный электрофорез (преэлектрофорез) до нанесения пробы [569, 799, 962, 1000], либо промывать гель буферным раствором [777, 778]. Бремер [168] попытался использовать для полимеризации разделяющего геля рибофлавин вместо персульфата, однако это привело к ухудшению разделения веществ и воспроизводимости результатов, причем полосы белка стали менее четкими [678]. Для защиты компонентов пробы от окисления персульфатом можно воспользоваться антиоксидантами (дитиотреитолом или 2-мер-каптоэтанолом), но необходимо учитывать, что эти вещества снижают скорость полимеризации акриламида, а при высоких концентрациях и вовсе препятствуют ей. Для преодоления этого нежелательного явления следует проводить полимеризацию при 37 °С, а не при комнатной температуре [798]. Нужно отметить, что персульфат, обладающий высоким удельным зарядом, движется в анионной системе впереди любого белка и, если применяется концентрирующий гель, никогда непосредственно не соприкасается с белками. Поэтому было высказано пред-
положение [168, 310], что в ряде случаев источником артефактов, вероятно, служит мочевина, а не персульфат.
Нидлс [907, 908] показал, что белки, аминокислоты и ионы буферных растворов существенно влияют на полимеризацию акрил амида. Так, трис и глицинат достаточно эффективно катализируют полимеризацию в отсутствие ТЕМЭД, а белки, наоборот, снижают скорость образования геля, что можно компенсировать повышением содержания ТЕМЭД.
При работе с высокими концентрациями акриламида (20% и выше) полимеризация геля часто происходит неравномерно из-за чрезвычайно энергичного выделения тепла [339]. Во избежание этого желательно уменьшить скорость реакции, что осуществляют, либо добавляя в гель феррицианид калия, либо просто исключая из него ТЕМЭД. Для предотвращения набухания поверхности геля рекомендуется [339] повысить концентрацию бис-акриламида и наслоить поверх раствора геля не воду, а изобутанол, который, однако, после завершения полимеризации нужно немедленно удалить, чтобы не вызвать дегидратации геля. Как уже отмечалось выше, скорость и качество полимеризации сильно зависят от условий протекания реакции (буферная система, pH, ионная сила, концентрации катализаторов и инициатора). Поэтому для получения воспроизводимых результатов эти условия необходимо стандартизовать.
ПРОВЕДЕНИЕ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА
После того как гель сформировался, резиновые колпачки или другие приспособления, закрывающие дно трубок, осторожно удаляют, а трубки вставляют в аппарат для электрофореза с помощью резиновых уплотнителей, резиновых пробок с отверстиями или нейлоновых прокладок. При этом концы трубок должны выступать из уплотнителей вверх примерно на 5 мм. Затем в электродные сосуды наливают охлажденный до 4°С буфер. Для удаления образующихся на концах трубок пузырьков воздуха используют пипетку с загнутым носиком или осторожно наклоняют трубки. Однако в последнем случае незапо-лимеризованные пробы могут сместиться или совсем вылиться.
Для наблюдения за движением электрофоретического фронта в анионной буферной системе <к 500 мл верхнего электродного буфера добавляют 2 мл 0,001 %-ного отфильтрованного раствора бромфенолового синего [416] или насыщенного раствора флуоресцеина. В катионной системе к 500 мл верхнего буфера добавляют 1 мл 0,005%-ного метилового зеленого, метиленового синего или пиронина Y [839]. Небольшие количества этих красителей можно вносить также и в отдельные пробы.
Далее электроды подключают к источнику постоянного тока и в течение первого получаса пропускают ток силой 1 (мА, а
затем 2—5 мА на 1 трубку. При большей силе тока выделяется слишком много тепла, что может привести к нежелательным последствиям.
После завершения электрофореза буферные растворы из верхнего и нижнего электродных сосудов сливают вместе, чтобы их можно было использовать повторно. Однако если пре-электрофорез не проводился, то анодный буфер, в котором будет присутствовать персульфат, следует вылить. Для того чтобы избежать сдвигов pH при длительном проведении электрофореза, особенно если применяются разбавленные буферы низкой емкости, рекомендуется обеспечить циркуляцию буферного раствора.
МЕТОД РАСЩЕПЛЕННОГО ГЕЛЯ
Даже если все процедуры тщательно выполняются при стандартных условиях, образование геля может проходить по-раз-ному в отдельных трубках из-за незначительных различий в их диаметрах, местных нарушений в процессе полимеризации, неравномерного выделения тепла и т. д. Поэтому сравнение двух белков путем электрофореза предпочтительно проводить в одном и том же геле при помощи так называемого «метода расщепленного геля», впервые разработанного Кларком [236]. Прямоугольный шаблон плотно вставляют в трубку и осторожно вдавливают в разделяющий гель на глубину около 1 мм, В каждую половинку геля вносят пробу. Чтобы свести к минимуму перекрывание проб, шаблон не следует вынимать из геля до тех пор, пока видимая полоска, образующаяся при перемещении пробы в электрическом поле, не проникнет в гель примерно на 1 мм.
