Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
1 2 3 k
Рис. 40. Электрофорез в
градиенте концентрации геля. 1 — начальная зона; 2 — сужение зоны в процессе электрофореза; 3 — зона становится очень узкой в конце разделения; 4 — скорость движения зоны приближается к нулю.
Время миграции, ч О 20 40 60 80 ЮО 120 1U0
! I I I I I
10-
60-
?
. 50 -
I».
}-
1 20-О
О
? ю-
0 5 Ю 15 20 25 30 35
Концентрация геля, %
Рис. 41. Миграция белков в вогнутом градиенте концентраций геля в пределах
4-35% [818].
На основании анализа графика Фергюсона Родбард и др.
[1108] заключили, что миграция макромолекул в градиенте геля не прекращается полностью вопреки предложению Марголп-са и Кенрика [820]. Скорость движения зон лишь асимптотически стремится к нулю при увеличении Т. Считают, что .размеры nqp в геле -подчиняются гауссову .распределению и что в геле всегда есть поры более крупных размеров, чем макромолекулы. Число таких крупных пор уменьшается при возрастании концентрации акриламида, но никогда не падает до нуля. С другой стороны, недавно было показано [372], что линейная зависимость между относительной подвижностью белко-в и логарифмом концентрации акриламида (при постоянной величине С) охватывает более широкий диапазон! размеров пор, чем это вытекает из графика Фергюсона:
lgT=\gTEL—KrU, (1)
где 7el — концентрация мономеров при нулевой скорости, а U — относительная подвижность при концентрации акриламида Т.
Из этого уравнения следует, что подвижность макромолекул в свободном растворе нельзя определять путем экстраполирования кривой, характеризующей подвижность макромолекул в геле (кривой запаздывания). Из него ясно также, что полная
остановка перемещения макромолекул действительно имеет место — она происходит в точке пересечения кривой запаздывания с осью, на которой отложены логарифмы концентраций акриламида.
Форму градиента (линейную или выпуклую), его длину, крутизну, диапазон концентраций можно варьировать в широких пределах, что позволяет на практике подобрать соответствующую систему градиентного геля для разделения любой смеси веществ.
Градиент концентрации геля получают путем смешивания разбавленного и концентрированного растворов геля в градиентном смесителе [819, 820]. Один
из таких приборов простого устройства, сконструированный Кирби, представлен на рис. 42. Во избежание конвекционных токов полимеризация геля в градиенте должна начинаться сверху [819, 820]. Для этого можно повысить содержание катализатора в разбавленном растворе геля или добавить феррицианид калия в более плотный раствор.
Градиент концентрации геля создают аналогично градиенту плотности сахарозы. Трубки заполняют раствором снизу. В конце смешивания применяют растворы сахарозы или глицерина, вытесняющие оставшуюся смесь компонентов геля в трубки.
Затем гель оставляют для полимеризации. Линейность градиен-
та можно проверить разными способами: 1) гель, разрезанный на части, высушивают и взвешивают; 2) один из растворов окрашивают бромфеноловьгм синим и определяют концентрацию красителя в градиенте; 3) наблюдают за перемещением н остановкой узких границ, образующихся при электрофоретическом разделении некоторых неоднородных смесей (например, фрагментированной ДНК) [51].
В настоящее время имеются в продаже уже готовые градиентные полиакриламидные гели, предназначенные главным образом для изучения сывороточных белков.
Градиентный гель обладает высокой разделяющей способностью (рис. 43). Было показано [657], что в геле с линейным
Рис. 42. Смеситель для получения градиента концентраций геля в маленьких колонках [673]. 1 — камера с магнитной мешалкой, изготовленная из шприца объемом 35 мл с прикрепленной к нему иголкой; 2 — резиновый колпачок; 3 — тайгоновая трубка; 4 — стеклянная трубка; 5 — тонкостенная тайюиовая трубка; 6 — зажимы; 7 — шприц с раствором мономера.
Рис. 43. Разделение белков сыворотки крови в полиакриламидном геле с линейным градиентом концентраций в пределах 4—30%.
градиентом концентрации в пределах 3,5—10% белки сыворотки крови человека дают 28 полос, в то время как в однородном геле обнаруживается лишь 21 полоса. Электрофорез в градиентном геле можно сочетать с каким-либо другим электрофоретическим методом во втором направлении, при этом компоненты исследуемой смеси разделяются еще лучше [670, 818, 819, 1391].
Электрофорез в градиенте концентрации полиакриламидного геля применяется не только для фракционирования белков, РНК [199] и нуклеопротеидных частиц [295, 876], но также и для определения молекулярной массы белков [39, 706, 1290] и РНК [876].
Электрофорез в ступенчатом градиенте концентрации полиакриламидного геля является более простым методом, который тоже дает хорошее разделение. В этом случае растворы геля с постепенно уменьшающимися концентрациями последовательно наслаивают друг на друга [235, 486].
