Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Джонс [637] предложил несколько иной вариант этого метода. Верхнюю ^поверхность геля тщательно высушивают кусочком фильтровальной бумаги, а исследуемые образцы, которые хотят сравнить, наносят на противоположные половинки диска диаметром 7 мм, вырезанного из фильтровальной бумаги ватман № 1. Для предотвращения смешивания проб в результате диффузии поперек диаметра диска тонким стеклянным капилляром заранее проводят линию из силиконового водоотталкивающего средства Silicone Repelcote (фирма Hopkins and Williams, Англия). Затем содержащий пробы диск опускают на высушенную поверхность геля и сразу наносят на него 1 мл раствора, использованного для приготовления проб. Трубки доверху заполняют электродным буфером и проводят электрофорез. В исследуемые пробы желательно вводить сахарозу, чтобы предотвратить их смешивание с электродным буфером.
«Метод расщепленного геля» весьма полезен при анализе таких сложных систем, как, например, рибосомные белки [782].
ДВУХСТОРОННИЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ
Если изучаемые белки имеют заряды разных знаков, то при использовании описанного 'выше прибора для диск-электрофореза часть макромолекул во время опыта будет потеряна. Для предотвращения таких потерь и выявления белков, движущихся вверх, Клар'К [236] рекомендовал помещать над исследуемой пробой еще один разделяющий гель высотой 2 см. Позднее Ра~ кусен [1047] модифицировал этот метод, соединив при помощи' пластмассовой вставки две трубки, в каждой из которых находился разделяющий гель в желаемом буфере. В пространство между трубками вводили 1 мл раствора концентрирующего геля, содержавшего пробу, и подвергали его фотополимеризации.
При исследовании рибосомных белков методом двухстороннего электрофореза [654] авторы помещали пробу между двумя разделяющими гелями. Столбик геля приготавливали в следующей последовательности: разделяющий гель — концентрирующий гель — стартовый гель — концентрирующий гель — разделяющий гель.
Диск-электрофорез с прослойкой из сефадекса. При изучении липопротеидов [707] была использована электрофоретическая система, состоящая из нескольких слоев акриламидного геля и сефадекса.
Метод электрофореза с изменением pH. Принцип этого метода заключается в том, что компоненты белковой смеси дважды подвергаются электрофоретическому разделению в одном и том же геле при разных pH. Этим способом удалось разделить два белка, различающихся лишь на одну единицу заряда [555]. Для первого электрофоретического разделения был выбран такой pH, при котором двигался лишь один компонент, тогда как другой оставался на старте. Затем pH изменили, заменив прежний буфер на новый, в результате чего второй компонент также приобрел заряд и электрофоретическую подвижность. Аналогичная методика была использована при изучении белковых комплексов [640].
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В СОСТАВНОМ АГАРОЗНО-ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ
Полиакриламидные гели низкой концентрации, применяемые при изучении, например, нуклеиновых кислот или нуклеопроте-идных частиц, обладают низкой механической прочностью. Для ее повышения предложено вводить в гель агарозу [984, 1324]. Способы приготовления составных и полиакриламидных гелей практически не отличаются друг от друга. Очищенную агарозу растворяют в воде при нагревании в колбе с обратным холодильником. Полученный раствор, в котором концентрация агарозы должна быть в два раза выше, чем ее конечная концент-
радия в геле, охлаждают до 40—42 °С. Раствор акриламадного геля, содержащий все компоненты в удвоенных концентрациях, нагревают до той же температуры и смешивают равные объемы обоих растворов. Полученную смесь с помощью предварительно подогретого шприца быстро вносят в трубки, сверху наслаивают воду и оставляют для полимеризации иа 45—60 мин [154, 573]. Чтобы гель не выскользнул из трубки, ее дно закрывают диализной мембраной, удерживаемой резиновым кольцом и кусочком резиновой трубки [154].
Рекомендуется использовать следующие концентрации компонентов геля: акриламид— 1,5—9%, бис-акриламвд— 0,08— 0,24%; агароза — 0,5%; ТЕМЭД— 0,6%; персульфат аммония— 0,01—0,06%. Применение ДМАПН вместо ТЕМЭД приводит к неравномерной полимеризации геля и исключительно высокому фону при 260 нм [154].
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В ГРАДИЕНТЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ГЕЛЯ
Слейтер [1192, 1193] применил электрофорез в градиенте концентрации полиакриламидного геля для исследования белков и показал, что белки из сьгворотки крови крысы разделялись при этом лучше, чем в однородных гелях.
Преимущество данного метода заключается в том, что электрофорез приводит к концентрированию компонентов разделяемой пробы, так как в замыкающей части каждой отдельной зоны электрофоретическая подвижность выше, чем в районе ее переднего фронта. Благодаря этому в ходе разделения полосы даже суживаются, а к концу электрофореза становятся
очень тонкими (рис. 40). Этот эффект самоконцентрирования особенно важен при изучении разбавленных растворов.
В градиенте концентрации геля скорость перемещения макромолекул определяется их зарядом в области низкой концентрации геля и их размерами в области высокой концентрации, так как эффект молекулярного сита существенно возрастает по мере продвижения молекул в более концентрированный гель [818—820, 1108]. В конце концов движение макромолекул прекращается. Для получения воспроизводимых результатов электрофорез следует проводить до тех пор, пока все компоненты смеси не перестанут двигаться (рис. 41).
