Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Очистка капилляров. Перед употреблением капилляры необходимо тщательно вымыть, так как любые примеси нередко приводят к искажению или ухудшению разделения. Для этого капилляры помещают в вакуум-эксикатор, наполовину заполненный хромовой смесью. Из него несколько раз откачивают воздух, после чего оставляют на ночь. Хромовую смесь сливают, а 'капилляры отмывают дистиллированной водой, желательно с применением вакуума. Затем их споласкивают несколько раз сначала абсолютным спиртом, а потом ацетоном и высушивают в течение ночи при 37 °С.
Можно очистить капилляры, прокипятив их в растворе детергента [602], а затем отмыть, как описано выше. Если капилляры необходимо использовать повторно, то рекомендуется сначала удалить из них остатки полиакриламидного геля концентрированным раствором гипохлорита калия.
Чтобы облегчить извлечение геля после электрофореза, иногда целесообразно силиконизировать капилляры. С этой целью их заполняют под действием капиллярных сил 2%-ным раствором диметилдихлорсилана в бензоле, который затем удаляют, промокая один конец капилляра фильтровальной бумагой. После этого капилляры высушивают при 90 °С в течение 1 ч.
Приготовление микрогеля. По мнению Нейхоффа [915], для получения хорошего разделения белков, необходимо соблюдать следующее правило; чем меньше диаметр капилляра, тем выше должна быть концентрация акриламида. Растворы гелей имеют такой же или почти такой же состав, как и при обычном диск-электрофорезе. Однако в данном случае рекомендуется добавлять в растворы тритон Х-100 до конечной концентрации 1% [44, 914] и гидантоин до конечной концентрации 5 мг/мл
[914]. Тритон Х-100 не влияет на разделение белков, но облегчает извлечение гелей из капилляров. Под действием гиданто-ина белковые полосы становятся более узкими. В электродном буфере глицин можно полностью заменить гидантоином [915]. Капилляры заполняются растворами гелей на */г—2/з их длины под действием сил поверхностного натяжения. Затем их втыкают в толстый (около 2 мм) слой пластилина, налепленного на дно небольшой чашки Петри. На поверхность раствора геля очень тонкой стеклянной пипеткой наслаивают воду вплоть до верхнего края капилляра. Это нужно делать чрезвычайно осторожно, чтобы избежать перемешивания воды с гелем. Полимеризацию гелей производят в вертикальном положении, причем желательно до употребления выдерживать их не менее 10 ч
[915]. Гели можно хранить без ущерба для них до двух дней, следя лишь за тем, чтобы их поверхность была покрыта водой. Удобно использовать для этих целей влажную камеру.
Перед проведением электрофореза слой воды с поверхности геля удаляют либо с помощью тонкой капиллярной пипетки, либо путем центрифугирования в течение 2 мин при наименьшей эффективной скорости. Поскольку концентрированные белковые растворы могут забивать поры в геле, целесообразно предварительно фракционировать белки перед электрофорезом. Для этого используют, например, слой сефадекса G-200 или G-100 [601]. На гель наносят желаемый буферный раствор, затем в него добавляют суспензию сефадекса на высоту 1—2 мм и капилляр центрифугируют для того, чтобы сефадекс осел на
поверхность геля. Однако в определенных условиях часть белков может проникнуть в щель между стенками трубки и гелем, особенно в верхней ее части, и замаскировать образовавшиеся здесь при разделении белковые полосы. Ней-хофф [915] показал, что сефадекс можно заменить слоем раствора сахарозы в буфере высотой 3—
5 мм. Другой способ предварительного фракционирования белков заключается в создании слоя относительно разбавленного 5%-ного геля толщиной 5—10 мм над более концентрированным 20% -ным разделяющим гелем. Перед полимеризацией 5%-ного геля на него наносят буфер для получения ровной поверхности.
Оптимальная концентрация белка в анализируемой смеси составляет 1—3 мг/мл. Более концентрированные растворы перед исследованием нужно развести, а ^ случае сильно разбавленных препаратов приходится наносить большие объемы. Для этого можно плотно соединить два или три капилляра при помощи маленького кусочка полиэтиленовой трубки с внутренним диаметром 1 мм или применить «систему перевернутого конуса» [185]. Белковый раствор, подвергаемый электрофорезу, обычно имеет объем 0,1 — 1 мкл. После отсасывания буфера с поверхности геля на нее капиллярной пипеткой наносят пробу. Если в качестве промежуточного слоя используют гель сефадекса или раствор сахарозы, то пробу наслаивают на них. Для равномерного нанесения пробы на гель и удаления с его поверхности пузырьков воздуха рекомендуется исследуемый раствор смещать на поверхность геля центрифугированием [369]. Все оставшееся после этого свободное пространство должно быть заполнено буфером. Часть капилляра, содержащую пластилин, отрезают острой пилкой для 'ампул или алмазным стеклорезом. Пластилиновую пробку можно также вытолкнуть, нажав сверху на гель буфером из шприца. Затем капилляры вставляют в перфорированные пластмассовые колпачки и укрепляют в отверстиях любого прибора для диск-электрофореза [369]. Их можно также присоединить к воронке [914] (рис. 44) или стеклянной труб-
