Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Гааль Э. -> "Электрофорез в разделении биологических макромолекул" -> 41

Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.

Гааль Э., Медьеши Г., Верецкеи Л. Электрофорез в разделении биологических макромолекул — М.: Мир, 1982. — 448 c.
Скачать (прямая ссылка): elektroforezvrazdeleniibiologicheskih1982.djvu
Предыдущая << 1 .. 35 36 37 38 39 40 < 41 > 42 43 44 45 46 47 .. 185 >> Следующая

Буфер, используемый при электрофорезе, должен иметь как можно более низкую ионную силу (0,005—0,02), что позволяет применять высокие градиенты напряжения вдоль геля при минимальном образовании тепла. Желательно, чтобы у элюирую-щего буфера ионная сила была выше, чем у буфера в геле, так как это помогает до некоторой степени уменьшить разведение выходящих из геля фракций. Буферные системы для препаративного электрофореза в полиакриламидном геле подробно изучены рядом авторов [322, 648].
Напряженность поля следует поддерживать настолько высокой, насколько это возможно по условиям образования и рассеяния тепла. Джовин и др. [648] нашли, что в описанном ими приборе плотность тока 5 мА/см2 была вполне допустимой, так как она обеспечивала градиент напряжения 10 В/см и мощность 0,5 Вт/см. Вообще, мощность не должна .превышать 10— 12 Вт, так как в противном случае разделившиеся зоны становятся вогнутыми из-за того, что в центре геля они движутся быстрее, чем у его поверхности [1094]. В начале опыта лучше использовать небольшой ток, чтобы образец плавно вошел в гель при минимальном нагреве и конвекции (1 ч и более). Скорость движения макромолекул в процессе препаративного электрофореза должна быть ниже их скорости в аналитическом опыте [1184].
Таблица 2
Концентрация полиакриламидных гелей, используемых для разделения макромолекул с различными молекулярными массами [839, 1184]
Концентрация геля Г, % Концентрация бис-акрил- Пределы разделения,
амида С, % дальтоны
15-20 0,2 МО4---4*10*
10-15 0,3 4-10*---1-10*
5---10 3---2 ЫО5---3-105
5 5 3-105---5-10*
2---5 6 Выше 5*10®
Концентрация полиакриламидного геля зависит от молекулярных масс веществ, подлежащих разделению (табл. 2). Как правило, величина 7тах (см. рис. 36), определенная при аналитическом электрофорезе в полиакриламидном геле, дает хорошие результаты и в опытах по препаративному разделению [232].
Длина блока геля определяется составом пробы. При использовании гелей длиной 5—10 см обычно получается вполне удовлетворительное разделение. При слишком длинных блоках происходит разведение фракций, особенно тех, которые выходят последними. Чтобы разделить два компонента, мигрирующих близко друг к другу, рекомендуется 'подобрать соответствующие условия, варьируя pH, напряженность поля, скорость элюции или концентрацию геля, а не увеличивать длину столбика геля, если она уже достигает 10 см [799].
Концентрирующий гель можно с успехом использовать в препаративной колонке (для которой иногда требуются большие количества геля), чтобы устранить нежелательные эффекты, вызванные наличием солей и отсутствием преэлектрофоре-за [1184]. Концентрация этого геля должна быть такой, чтобы белки до вхождения в разделяющий гель подверглись предварительному фракционированию в соответствии с размерами их молекул. Подобным способом можно предотвратить закупоривание разделяющего геля концентрированным раствором белков. Если же исследуемая проба очень разбавлена, то рекомендуется применить более разведенный концентрирующий гель,, не обладающий свойствами молекулярного сита. Это даст возможность сконцентрировать белковые компоненты при помощи изотахофореза. Таким образом, концентрирующий гель играет довольно существенную роль при препаративном электрофорезе в полиакриламидном геле.
Было отмечено [253], что концентрацию 6«с-акриламида следует уменьшить примерно в три раза по сравнению с той,, которая используется в аналитических гелях, так как высокое содержание бис-а-криламида может привести к искажению формы зон.
Количество материала, фракционируемого в одном опыте,, зависит от площади поперечного сечения геля, температуры во1 время электрофореза и состава разделяемой смеси. Обычно целесообразно наносить до 10 мг белка на 1 см2 поверхности геля, но, если белки движутся слишком близко друг к другу, это количество необходимо снизить примерно до 2 мг/см2 [1094].
Температура является важным фактором при препаративном электрофорезе в полиакриламидном геле. Если охлаждение недостаточно, то участки зон, расположенные в более нагретой области геля, будут двигаться быстрее, чем находящие-
ся в более холодной области. В результате неодинаковой скорости миграции отдельных участков зоны искривятся, что приведет к загрязнению разделившихся фракций компонентами предшествующей или -последующей зон. Для обеспечения надлежащего охлаждения разработано много разных устройств. Они будут детально рассмотрены ниже.
В элюционной камере из-за различий в температурах геля и элюирующего буфера возникает температурный градиент, в результате чего белки оказываются непосредственно под нижней поверхностью геля. Поэтому целесообразно, чтобы элюирующий буфер вытекал из элюционной камеры вверх через центр геля.
Предыдущая << 1 .. 35 36 37 38 39 40 < 41 > 42 43 44 45 46 47 .. 185 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed