Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Электрофорез в градиенте концентрации полиакриламидного геля можно проводить также в присутствии ДСН, но в этом
случае нельзя одновременно употреблять тритон X-100, так как он может шомешать разделению белков.
Микроэлектрофорез на пластинах геля. Для разделения изоферментов ЛДГ отдельных клеток Корочкин и др. [710] использовали плоские стеклянные капилляры (размерами IX Х2 мм, 50ХЮ0 мкм, 25X50 мкм). Этот метод достаточно чувствителен, чтобы определить 1 нг белка. Маурер и Дати [842, 843] сконструировали простой прибор для электрофореза на пластинах'геля, состоящий из двух предметных стекол, и исследовали в нем белки сыворотки крови человека, причем пробы имели объем 2—3 мкл и содержали около 15 мкг белка. Для изучения РНК была разработана методика проведения электрофореза на микропластинке из акриламидного [335] или смешанного агарозно-акриламидного геля [1099]. Согласно этой методике, раствор геля полимеризуют в форме из плексигласа размером 45X50X0,1 мм. Из полученного блока геля при помощи бритвы вырезают узкие полооки (размером 30Х4Х Х0,1 мм), которые выдерживают 6—8 ч при комнатной температуре в буферном растворе, содержащем глюкозу (4 г/мл), а затем хранят при 4°С. Перед опытом каждую полоску геля помещают на кварцевую пластину, прорезают бритвой канавки для проб шириной около 100 мкм и ©носят в них по 0,1 мкл исследуемого раствора, содержащего 0,5—1 нг РНК. Электрофорез проводят по методу, описанному в разд. 1.9.2 [1419].
В зависимости от сложности разделяемой смеси путь, который должны пройти ее компоненты, составляет 100—500 мкм. Преимущество данной методики заключается в том, что в полоске геля можно прорезать много канавок и таким образом исследовать целую серию проб в одно'м и том же геле.
Источники ошибок при микроэлектрофорезе в геле. В плохо отмытых или силиконизированных капиллярах нередко возникают искусственные зоны и другие артефакты. Следы ацетона, очень быстрая полимеризация, а также слишком большие концентрации акриламида или бис-акриламида вызывают помутнение гелей. При недостаточно аккуратном приготовлении геля «ли при использовании чрезмерно высоких градиентов напряжения в геле образуются пузырьки (воздуха. Если исходный раствор акриламида не был предварительно нагрет до комнатной температуры, то он может закристаллизоваться внутри ка* пилляра, особенно в тех зонах градиентных гелей, где акрил-амид содержится в высоких концентрациях.
В случае длительного хранения геля до его использования он может отслоиться от стенок капилляра, и при электрофоре' зе в эту щель проникнут белки.
Если градиентные гели готовят по методу Нейхоффа {915] с использованием сил поверхностного натяжения, то засасыва-
ние в капилляр недостаточного количества раствора персуль-фата амман-ия приведет к полной полимеризации находящейся в нем жидкости и в капилляре не останется места для внесения пробы. Если полимеризация протекает слишком быстро,, то образуется неоднородный гель, в котором зоны будут иметь стреловидную форму.
Описанные выше приемы позволяют исследовать белки и нуклеиновые кислоты в пикограммовых количествах. Это особенно существенно для нейрохимии, так как здесь необходимо анализировать белковый состав отдельных клеток [44, 601,
602, 914].
См еде [1194, 1195] исследовал белковый состав в отдельных фолликулах щитовидной железы крысы при помощи электрофореза в капиллярах. Ховард и Траут [585] модифицировали микрометод, разработанный Кальтшмидтом и Виттманном [654], применив его для двухмерного разделения рибосомных белков. В лаборатории Нейхоффа разработано множество про-стых приемов для характеристики ферментов [257, 916, 911Г 919, 920] (см. также обзор Нейхоффа [915]).
Использование в качестве поддерживающей среды нитей полиакриламидного геля позволило выяснить содержание различных гемоглобинов в отдельных эритроцитах [834]. Приме-нив для наблюдения микроскоп, удалось определить до 7-. Ю-I3 г гемоглобина.
L11.4. Препаративный электрофорез в полиакриламидном геле
Высокая разрешающая способность электрофореза в полиакриламидном геле навела исследователей на мысль об использовании его для очистки белков и нуклеиновых кислот в препаративных целях. Для этого были разработаны различные типы приборов и буферных систем, позволившие увеличить производительность метода без ухудшения .качества разделения.
ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ ПРЕПАРАТИВНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ
Чтобы получить хорошие результаты при проведении препара-тивного электрофореза, необходимо подобрать для него оптимальные условия (pH и ионную силу буфера, напряженность электрического поля, высоту и концентрацию геля, количества разделяемого материала [232, 450]) при помощи аналитического электрофореза. Простое увеличение размеров геля при-
водит к избыточному образованию тепла и потере отдельных белков, а порой и к менее эффективному разделению. Поэтому способы охлаждения приборов и элюции белков заслуживают особого внимания.
Значения pH буферных растворов следует выбирать с таким расчетом, чтобы различия в зарядах между компонентами разделяемой омеои были максимальными. Чем больше разница между pH рреды и pi макромолекул, тем быстрее они движутся и тем уже их зоны.
