Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В ПЛАСТИНАХ ПОЛИАКРИЛАМИДНОГО ГЕЛЯ
Использование пластин геля вместо столбиков имеет ряд преимуществ [842, 843]. На одной и той же пластине геля в идентичных условиях можно исследовать несколько образцов; пр'И сравнении результатов и их оптической оценке, а также высушивании геля не возникает никаких затруднений. Чувствительность метода с применением пластин выше, а рассеяние тепла лучше, чем при электрофорезе в столбиках геля. Поверхностный эффект почти отсутствует [1062]. С другой стороны, для работы с пластинами требуются более сложные и дорогие приборы и относительно большие количества акриламида.
Электрофорез в пластинах геля можно проводить в верти* кальном или горизонтальном положении. Этому методу посвящено значительное число работ [12, 1061, 1069, 1427]. Он используется также для двухмерного разделения белковых смесей [1, 129, 654, 765, 1062, 1102].
Приборы, позволяющие одновременно анализировать до 49' проб, созданы и описаны рядом авторов [113, 994, 1242, 1243,.
1291, 1448]. Эти устройства особенно удобны в тех случаях, когда необходимо проводить массовые анализы многочисленных образцов.
Обычно не рекомендуют использовать горизонтальный гель-электрофорез [67, 577], так как во время опыта может произойти электрообезвоживание геля, что вызовет искажение полученных результатов.
Пластины геля готовят в основном таким же образом, как и столбики. В продаже имеется несколько типов приборов для работы с пластинами.
ИСТОЧНИКИ ОШИБОК ПРИ ЭЛЕКТРОФОРЕЗЕ В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ
Температура является критическим фактором при электрофорезе, оказывающим существенное влияние на подвижность белков [130] вследствие того, что при понижении температуры вязкость воды повышается. В то же время повышение температуры только на 1 °С (с 17 до 18°С) приводит к тому, что скорость перемещения белков увеличивается более чем на 20%. Если отвод тепла недостаточен, то образуются искривленные полосы, так как центральная часть геля обычно нагревается сильнее, чем края, и потому подвижность макромолекул в ней выше. Для устранения этого эффекта нужно использовать более разбавленный гель или буферный раствор, а электрофорез проводить в холодильнике.
Причиной искривления полос может быть также слишком быстрая полимеризация геля, приводящая к его неравномерному сжатию и слишком сильному прилипанию к стеклянным стенкам. В этом случае целесообразно снизить концентрацию ТЕМЭД или персульфата либо добавить к раствору феррициа-нид калия.
Старение геля, недостаточно чистые реактивы, пузырьки воздуха или неаккуратное наслаивание воды могут вызвать более или менее серьезные искажения результатов. Вследствие осаждения белков, особенно на границе концентрирующего и разделяющего гелей, образуются хвосты (рис. 19). Выпадение белков в осадок относят за счет их чрезмерного концентрирования или взаимодействий типа белок — белок [303].
Плохое разделение компонентов исследуемой смеси может быть также результатом недостаточной длительности опыта, неподходящей концентрации геля, неудачного выбора ионной силы и pH буфера, слишком высокой ионной силы раствора, содержащего пробу, избыточного выделения тепла или просачивания буфера между стенкой трубки и гелем.
МИКРОЭЛЕКТРОФОРЕЗ В ПОЛИАКРИЛАМИДНЫХ ГЕЛЯХ
В некоторых случаях, например когда в результате длительной очистки удается получить лишь очень малые количества материала или при необходимости исследовать компоненты отдельных клеток, приходится прибегать к микроварианту электрофоретического разделения белков и нуклеиновых кислот. В то же время микроанализ в полиакриламидном геле сам по себе обладает рядом преимуществ. Так, более короткое время, затрачиваемое на проведение электрофореза, а также на окрашивание и обесцвечивание гелей, делает применение микроанализа целесообразным даже тогда, когда материала вполне достаточно для макроварианта. Микрометодика при наличии определенного опыта едва ли намного сложнее обычного диск-электрофореза, хотя требует такого специального оборудования, как микропипетки, микроманипулятор, лупа и микроденситометр. Читатели, интересующиеся деталями этого метода, могут обратиться к монографии Нейхоффа [915], в которой помимо электрофореза освещены и другие виды работ с микроколичествами материала (гомогенизация, диализ, фотометрия, центрифугирование в капиллярах и т. д.).
Описан прибор для электрофореза в полиакриламидном геле, предназначенный для исследования малых количеств белков мозга [1042]. В нем используются микроячейки (размером 1,8X1,0X70 мм), позволяющие изучать белки, содержащиеся в 0,8—2 мг ткани. Для уменьшения необходимого для анализа количества материала применяют капилляры с внутренним диаметром 1—1,5 мм [132, 369, 1058]. Однако все эти приемы не достигают уровня настоящего микроэлектрофореза, при использовании которого требуется лишь 10~6—10~12 г вещества.
Грособах [484] предложил для разделения белков пользоваться микрокапиллярами фирмы Drummond, различающимися по своим размерам и вмещающими разные объемы жидкости ( 1, 2, 5 и 10 мкл). Чаще всего опыты ставят в капиллярах объемом 5 мкл с внутренним диаметром 0,45 мм и длиной 33 мм. Так как объем капилляра составляет точно 5 мкл, его диаметр и длина могут несколько варьировать.
