Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
20 г обработанного щелочью агара помещают в воду и дают ему набухнуть, а затем для удаления воды промывают его шестью порциями этанола. После этого гранулы агара переносят в двухлитровую круглую колбу и суспендируют в 100 мл диоксана, который необходимо предварительно очистить следующим образом. Около 125 г катионообменной смолы (дау-экс 50W—Х8(Н), 20—50 меш) переводят в калиевую форму двукратной обработкой рассчитанным количеством КОН, затем отмывают дистиллированной водой до нейтральной реакции и сушат в течение ночи при 150°С. После охлаждения до комнатной температуры ионообменник помещают в цилиндрическую делительную воронку на 250 мл и через него медленно пропускают 350 мл диоксана (содержащего не менее 98% основного вещества и менее 0,5% воды). Для восстановления перекисей к диоксану добавляют 0,3 г NaBH4, а затем смесь подвергают перегонке. При этом первые 10—15 мл дистиллята отбрасывают и перегонку прекращают, когда в колбе остается ~ 100 мл жидкости. Полученный перегнанный диоксан используют в качестве растворителя при восстановлении обработанного щелочью агара. Для этого 10 г LiAlH4 суспендируют в 50—100 мл диоксана и омесь переливают в капельную воронку, которую устанавливают на двухлитровую колбу, содержащую суспензию агара в 100 мл диоксана. Эту колбу, оборудованную термометром, обратным холодильником и магнитной мешалкой, помещают в масляную баню и доводят примерно до 75°С. Затем в нее из делительной воронки приливают небольшими порциями LiAlH4. При этом в процессе реакции температура возрастает. После внесения всего объема LiAlH4 реакционную смесь выдерживают еще 1 ч при 90 °С, а затем реакцию останавливают, охлаждая амесь до 10 °С в ледяной бане. Избыток LiAlH4 удаляют добавлением 50 мл этилацетата. Важно отметить, что реакция с этилацетатом протекает с выделением большого количества тепла, и поэтому его следует приливать очень медленно во избежание разложения агара. Продукты реакции гидролизуют осторожным добавлением ледяной воды вплоть до полного прекращения реакции. Образовавшийся осадок растворяют, добавляя к нему охлажденную на льду 1 н. НС1 до достижения кислого pH (обычно требуется около 1 л). Агар немедленно отфильтровывают и промывают сначала охлажденной 0,1 н. НС1, а затем большим количеством воды.
i
I
s-е
+
4
1
2
Рис. 20. Электрофорез в агаровом геле [461]. Гель (/), расположенный на стеклянной пластинке (2), опускается в электродный буфер (5); бумажные полоски (4) поддерживают агаровые мостики. Пробу вносят в щель (5) и обеспечивают циркуляцию буфера (6).
Электроосмос в обработанном щелочью и восстановленном агаре почти отсутствует.
Иоханссон и Йертен [631] очищали агарозу методом ионообменной хроматографии на колонке с QAE-сефадексом и добавляли в агарозный гель полиакриламид. Это также приводило к получению агарозного геля с сильно уменьшенным элект-роосмотич'еокюм током.
30 г QAE-сефадекса, уравновешенного 0,001 М буфером трис-НС1, pH 7,4, помещают в термостатированную при 60 °С колонку размером 5ХЮ0 см. Затем в колонку вносят раствор, содержащий 15 г агарозы в 1 л буфера. Элюцию проводят тем же буфером оо скоростью 100 мл/ч. Фракции, превратившиеся в гель, подвергают замораживанию и оттаиванию. Гель, утративший большую часть жидкости, гомогенизируют, промывают дистиллированной водой и лиофилизируют. Авторы отмечают, что при такой обработке выход агарозы составляет 2/3 от исходного материала, содержание серы снижается в 10 раз, а электрооомотичеокий ток — в 2—3 раза.
Грабб [492] применил иной подход для получения агарозы, в которой не возникало бы электроосмотичеокого тока. Он ввел в нее положительные заряды, обработав GNBr-активированную агарозу 2-аминоэтилтриметиламмонийбромидом (гидробромидом). Степень замещения зависела от количества использованного CNBr. Производное агарозы с положительным электроосмосом можно смешать с необработанной агарозой и получить гель с нулевым электроосмосом.
Электрофоретические методики. Грабар и Уильямс [461] приспособили метод Гордона и др. [451] для электрофоретического исследования белков. Это устройство показано на рис. 20. Применяются следующие материалы:
1. Раствор агарового геля, содержащий агар и буфер в требуемых концентрациях.
Рис. 21. Заливка агарового геля [1419]. 1 — нижний слой; 2 — верхний слой. Стеклянная пластинка {«?), расположенная между двумя слоями геля, покрыта с обоих концов полосками фильтровальной бумаги (4). Гель разрезают по контуру стеклянной пластинки с полосками фильтровальной бумаги.
2. Стеклянные пластинки (13X18 см), покрытые 0,1%-ным раствором агара и высушенные при 80 °С. Это делается для того, чтобы агаровый гель лучше прилипал к стеклу.
3. Слой агарового геля с совершенно гладкой и ровной поверхностью. Для его получения раствор агара того же состава, что и среда для электрофореза, наливают в фотографическую кювету или чашку Петри слоем толщиной несколько миллиметров и дают ему застыть.
Приготовление пластинок для электрофореза. Исходный 2,5%-ный раствор агара расплавляют в кипящей водяной бане и после просветления к нему добавляют концентрированный буфер до получения желаемой концентрации агара. Стеклянные пластинки помещают на уже застывший в фотографической кювете или чашке Петри гель. Вырезают два листа хроматографической бумаги размером 13X4 см, пропитывают их буфером для электрофореза и накладывают на оба конца стеклянной пластинки так, чтобы они закрывали на ней участки шириной 1 см (рис. 21). Затем в кювету или чашку наливают расплавленный горячий (около 60 °С) раствор агара, который должен покрыть пластинку, хроматографическую бумагу и свободные края нижнего поддерживающего геля слоем толщиной около 4 мм. Необходимое для этого количество раствора агара определяют расчетным или экспериментальным путем. После застывания геля в нем примерно посередине при помощи шаб*
