Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
лона размером 15X4 мм прорезают канавки и удаляют из них гель отсасыванием. Далее скальпелем или бритвой вырезают блок геля с заключенной в него пластинкой вместе с наложенными на нее кусками фильтровальной бумаги, вынимают этот блок из кюветы или чашки Петри и переносят в аппарат для электрофореза.
Аппарат для электрофореза состоит из двух кювет высотой 6 ом и шириной 7 ом, служащих электродными сосудами. Их длина подбирается соответственно числу одновременно используемых пластинок. В каждой кювете по всей ее длине проходит платиновая проволока. Сосуды заполняют буфером для электрофореза, наливая его до уровня верхнего сливного отверстия. Рекомендуется обеспечить циркуляцию буфера, чтобы избежать изменений его pH при проведении опыта. В буфер опускают полоски бумаги, покрытые слоем геля.
Пробу составляют из равных объемов растврра агара (температура 45°С), концентрация которого должна быть в два раза выше, чем его концентрация в геле, и исследуемого раствора. Пробу пипеткой вносят в щель. Термолабильный материал смешивают с холодной агаровой пастой. После внесения проб щели заливают используемым для электрофореза раствором агара. Горячим агаром заравнивают также трещины и изломы, образовавшиеся в месте перехода от пластинки к фильтровальной бумаге, и после его застывания включают электрический ток (40—50 мА).
В оригинальной статье Грабара и Уильямса [461] указано, что разделенные при электрофорезе белки подвергали иммунодиффузии, чтобы охарактеризовать компоненты по их антигенным свойствам (им'муноэлектрофорез, см. гл. 11.4).
Бирд и Джексон [121] несколько модифицировали описанный метод и предложили использовать в качестве подложки не стеклянные пластинки, а рентгеновскую пленку, что позволило избежать образования трещин в геле. Разделение они проводили в камере для бумажного электрофореза, а гель накрывали листом целлулоида, слегка смазанного минеральным маслом.
Шайдеггер [1126] приспособил методику Грабара и Уильямса для разделения малых количеств материала, чтобы сэкономить антисыворотку, используемую при иммуноэлектрофорезе. На предметные стекла, уложенные на подставку, установленную в строго горизонтальном положении, наливают раствор агара слоем толщиной 2 мм. Раствор не стекает с них благодаря силам поверхностного натяжения. После застывания геля в нем вырезают круглые отверстая диаметром 1 мм и заполняют их исследуемой пробой. Контакт с электродными сосудами осуществляется с помощью полосок фильтровальной бумаги. Электрофорез проводят при низкой напряженности поля
Б
Рис. 22. А. Схематическое! изображение прибора для электрофореза в агаровом геле на стеклянных пластинках. 1 — металлическая коробка с ножками на винтах и охлаждающее устройство; 2 — стеклянная пластинка; 3—агаровый гель; 4 — агаровый гель или пенопласт; 5 — электродные сосуды. Б. Шаблон для формирования щелей.
(6 В/см). Компоненты белковой смеси выявляют, используя 25 мкл антисыворотки.
Гири [438—440] получил слой агарового геля на стеклянной пластинке, вмонтированной в пластмассовую рамку, прокладывая между стеклом и гелем лист целлофана, чтобы потом гель легко можно было снять со стекла. На основе этой работы была создана методика электрофореза на пластинках с агаровым гелем для разделения нуклеиновых кислот [1304—1307] и белков [630]. Поскольку она достаточно проста и может быть воспроизведена в любой лаборатории, мы рассмотрим ее подробно.
Прибор состоит из металлической коробки, электродных сосудов и приспособлений, необходимых для приготовления геля. Металлическая коробка термостатируется циркулирующей водой и может быть установлена в горизонтальном положении при помощи винтовых ножек (рис. 22). В электродных сосудах находятся электроды, представляющие собой протянутую вдоль всего дна платиновую проволоку. В каждом сосуде имеется также входное и выходное отверстия для циркуляции буфера. Стеклянные пластинки предварительно смазывают силиконовым маслом и высушивают в печи. Это делают для того, чтобы после электрофореза высохший агар легко можно было снять со стекла. Затем пластинку прикрепляют к пластмассовой рамке зажимами для резиновых трубок и кладут на металлическую коробку, которую тщательно устанавливают в горизонтальное положение. На пластинку выливают теплый (60°С) раствор агара в электрофоретическом буфере. Поверхность
раствора выравнивают листом пластмассы и удаляют им всплывшие примеси. На рамку кладут сделанный из пластмассы шаблон для получения канавок в геле и все накрывают пластмассовой крышкой для предотвращения излишнего испарения. Через 15 мин, когда гель застывает, из него вынимают шаблон, поднимая его строго вертикально. Толщина геля должна составлять 3 мм, а глубина канавок 2 мм. Затем гель обрезают скальпелем или бритвой вдоль рамки и последнюю вместе с зажимами убирают, а стеклянную пластинку с гелем оставляют на металлической коробке, температуру которой поддерживают постоянной на уровне 10—12 °С. В канавки вносят пипеткой исследуемые пробы и пластинку с гелем соединяют с электродными сосудами при помощи мостиков из пористой пластмассы или агарового геля. Из пористой пластмассы необходимо предварительно удалить все пузырьки воздуха, выжимая ее под слоем буфера. Наконец, включают напряжение (около 6 В/см) и проводят электрофорез в течение необходимого времени. Если в исследуемую пробу не был заранее добавлен агар, то в процессе электрофореза в канавки нужно несколько раз подливать буфер во избежание его полного испарения, а в конце электрофореза залить канавки раствором агара, чтобы после высушивания гель не порвался. После окончания электрофореза на края пластинки наливают теплый раствор агара, а затем гель высушивают или окрашивают.
