Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Суспензия частиц агарозного геля в качестве поддерживающей среды была предложена в 1963 г. Иертеном [564]. Обычно используется 0,15—0,18%-ный агарозный гель, поэтому эффект молекулярного еита практически отсутствует даже для веществ с очень высокой молекулярной массой, а роль адсорбции не существенна.
1.8.1. Электрофорез в горизонтальных блоках
Этот метод зонального электрофореза был впервые предложен в 1952 г. Кункелем и Слейтером [727] и впоследствии успешно применялся во многих областях, таких, как разделение ли-попротеидов крови [729], компонентов системы комплемента [893], гемоглобинов [730] и др.
Прибор для проведения электрофореза такого типа устроен весьма просто. Он состоит из двух электродных сосудов и лотка для поддержания блока (рис. 15). Лоток можно изготовить из стеклянной или плексигласовой пластины соответствующего размера и двух плексигласовых брусков, расположенных вдоль боковых сторон пластины параллельно направлению электрофоретической миграции. Пластину и бруски покрывают листом тонкой полиэтиленовой пленки (рис. 16). К двум другим сторонам пластины плотно прижимают стопки толстой фильтровальной бумаги [898]. Можно также воспользоваться лотком с уже готовыми продольными стенками. В этом случае в дне лотка с обеих его сторон, расположенных перпендикулярно направлению электрофореза, прорезают две щели, в кото-
рые вставляют губчатые прокладки, служащие одновременно боковыми стенками лотка и фитилями, погружаемыми в буферный раствор во время электрофореза [13951.
Блоки могут быть разной величины: шириной от 10 до
60 ом и длиной от 30 до 50 см. Нецелесообразно делать их толще 7—9 мм из-за трудностей, связанных с отводом большого количества тепла.
Поддерживающую среду, чаще всего гранулированный картофельный крахмал или певтикон, промывают на воронке Бюхнера сначала большим количеством дистиллированной воды, а затем используемым ггри электрофорезе буфером. В конце промывки уплотнившийся материал суспендируют путем перемешивания в буферном растворе, который добавляют малыми порциями до тех пор, пока не будет достигнута соответствующая консистенция, а именно кашица должна литься и при этом не иметь избытка жидкости. Затем полученную кашицу
Рис. 16. Приспособление для приготовления электрофоретических блоков из певикона или крахмала [893]. 1 — пластина из плексигласа; 2— бруски из
плексигласа; 3 — лист тонкой полимерной пленки; 4 — стопки фильтровальной
бумаги.
переливают в описанные выше поддерживающие лотки (рис. 15 и 16). Излишек буфера из лотка первого типа отсасывается расположенными с двух сторон стопками фильтровальной бумаги, которые при необходимости можно заменить на свежие. При использовании лотка второго типа лишнюю влагу удаляют с помощью листов фильтровальной бумаги, помещенных поверх блока. Эту процедуру можно облегчить, положив сразу несколько слоев бумаги и прижав их тяжелой стеклянной пластиной.
После того как блок достаточно осушен, в нем с помощью линейки маленьким шпателем вырезают узкие щели, их длина не должна превышать 10 см. С каждой стороны от щели нужно оставить достаточно большие поля. Щель можно несколько расширить шпателем для придания ей V-образной формы. Пробы вводят в щел'И капиллярной пипеткой или шприцем с тонкой иглой. Объем проб обычно составляет 0,1—0,3 мл на 1 см длины щели. Желательно, чтобы концентрация разделяемых белков была около 5%. После того как проба введена в щель, ей дают в течение /нескольких минут всосаться в блок, а затем края щели осторожно сжимают, соединяя их вместе, и поверхность блока заглаживают.
Далее блок помещают на свое место в электрофоретическую камеру. В первом варианте контакт с буферным раствором осуществляется посредством фитилей из полотенечной ткани или нескольких слоев фильтровальной бумаги. Во втором — электрический контакт обеспечивается с помощью губки из вискозы, вставленной в щель в дне лотка.
Как и в других видах горизонтального зонального электрофореза, положение стартовой линии следует выбирать, принимая во внимание свойства подлежащих разделению макромолекул и уровень электроосмоса при данных условиях. Этот уровень, разумеется, зависит от свойств поддерживающего материала (в крахмале он заметно выше, чем в певиконе), а также от pH и состава буфера. Если производится разделение бесцветных веществ, то за их перемещением можно следить, добавляя в пробу краситель, например бромфеноловый синий. Для предотвращения испарения с поверхности блока края полиэтиленовой пленки осторожно загибают вверх и укладывают на блок (лоток первого типа) или накрывают поверхность блока куском оберточного материала фирмы Saran (лоток второго типа). Электрофорез обычно проводят в холодной комнате. Перед включением напряжения блоку нужно дать остыть до температуры окружающего воздуха. При ионной силе буфера 0,05 целесообразно применять градиенты напряжения в 3,5—5 В/см.
После завершения электрофореза фракции можно выявить и выделить несколькими способами. Во-первых, если разделены
