Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
перемещение. Поверхность капиллярной системы поддерживающего матер-иала также может нести электрический заряд (обычно отрицательный). Поскольку эта система представляет собой стационарную фазу, данный эффект переносится на буферный раствор, который, будучи положительно заряженным в отличие от поверхности поддерживающего материала, будет течь по направлению к катоду. Степень электроосмоса сильно варьирует для разных стабилизирующих сред. Кроме того, в некоторых случаях в результате испарения происходят изменения в проводимости и pH буфера. Важное значение может приобретать адсорбция движущихся веществ на поддерживающем материале.
Точное определение электрофоретической подвижности представляет значительные трудности. На практике рассчитывают лишь относительную подвижность исследуемого вещества по сравнению с каким-либо стандартным веществом с известной подвижностью [729]. Кроме измерения расстояния, пройденного исследуемым образцом и стандартным веществом, нужно определить также путь, отделяющий от старта так называемую зону нулевой подвижности. Это необходимо для внесения поправки на любое смещение веществ, вызванное не электрофорезом, а какими-то иными силами (электрооомотическим током или током буфера из-за испарения среды). Экспериментально перемещение зоны нулевой подвижности может быть оценено путем наблюдения за движением какого-нибудь незаряженного вещества, например декстрана [728], глюкозы и ксилозы [1152] или кофеина [258]. Относительную подвижность рассчитывают по формуле
где Uc — подвижность стандартного вещества (определенная методом подвижной границы), m0, тс и т — расстояния, пройденные от стартовой линии соответственно зоной нулевой подвижности, стандартным веществом и исследуемым веществом. Подвижность, определенная этим способом, является хорошим приближением к подвижности в свободной среде в том случае, если движение исследуемого и стандартного веществ не замедляется при использованных условиях вследствие эффекта молекулярного сита или адсорбции.
1.6. Электрофорез
на фильтровальной бумаге
В 1950 г. сообщения об успешном использовании зонального электрофореза на фильтровальной бумаге для разделения омесей макромолекулярных веществ поступили сразу из шести лабораторий [256, 326, 467, 714, 848, 1313]. Этот метод нашел чрезвычайно широкое применение и фактически открыл путь для обширных аналитических исследований во многих областях. К настоящему времени значение его снизилось в связи с использованием других сред, более подходящих для зонального электрофореза.
Фильтровальная бумага для электрофореза должна содержать по крайней мере 96% а-целлюлозы, нерастворимой в концентрированном растворе NaOH. В процессе электрофореза она пропитывается буферным раствором. Разные марки бумаги обладают неодинаковой впитывающей способностью — свойством, имеющим большое значение, так как электропроводность влажной фильтровальной бумаги зависит от объема содержащегося в ней буфера. Вандерли [1463] определил впитывающую способность нескольких типов фильтровальной бумаги (количество воды, впитывающейся за 1 мин полоской размером 3X20 см). Тонкая или средней толщины бумага с плотной текстурой дает при электрофорезе четкий фронт, тогда как толстая «быстро протекающая» бумага, обладающая большой впитывающей способностью, характеризуется нечетким фронтом.
Движение жидкости в бумаге может быть вызвано элект-рооомосом и другими причинами, рассмотренными ниже. Если уровень буферного раствора в обоих электродных сосудах не одинаков, возникает сифонный эффект. Важную роль играет испарение жидкости под действием джоулева тепла, образующегося при протекании электрического тока. Оно приводит к повышению концентрации электролита в бумаге и, следовательно, к увеличению ионной силы. Степень испарения жидкости изменяется в зависимости от расстояния между данным участком бумаги и сосудом с буферам, в результате чего возникает ток буфера. В установках, где полоока бумаги перекинута через опорную планку, наиболее сильное испарение происходит вблизи сосудов с буфером [791, 792]. Его можно поддержи-
Рис. 10. Прибор для электрофореза на бумаге [1424]. Видны свободно свисающие полоски бумаги.
вать на минимальном уровне, используя буфер с достаточно низкой ионной оилой. Описан также прибор с охлаждением [256]. Ток буфера можно устранить, регулируя испарение [791, 792], а испарение можно предотвратить путем создания в электрофоретической камере атмосферы насыщенных паров [933]. Испарение можно также снизить, добавляя в буфер 5— 15% пропиленгликоля или глицерина [133].
ПРИБОРЫ
Приборы всех типов состоят из двух электродных сосудов и устройства для поддерживания полосок или листов бумаги в определенном положении между сосудами. В качестве электродов обычно применяют платиновую проволоку. Катод можно сделать и из какого-либо другого металла, однако в этом слу-
Рис. 12. Аппликатор для нанесения проб на бумагу (фирма Beckman).
чае необходимо следить за тем, чтобы не перепутать полярность электродов. Можно использовать также угольные электроды, но их следует помещать в целлофановые трубки, предотвращающие загрязнение буфера частичками угля. Во всех приборах в сосудах с буфером создается лабиринтная система для отделения продуктов электролиза, образующихся у электродов, от полосок бумаги. Для предотвращения чрезмерного испарения всю систему помещают в закрытую камеру, что обеспечивает создание влажной атмосферы. В некоторых случаях влажные полоски бумаги кладут между стеклянными пластинками и погружают в баню с хлорбензолом [256, 1140]. Это делается для эффективного отвода тепла, образующегося при более высоких градиентах напряжения. Оказалось, однако, что высокие градиенты напряжения не дают особого преимущества, и поэтому в большинстве исследований применяются приборы с влажной камерой и низкой напряженностью поля.
