Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
При использовании гранулированной поддерживающей среды, обладающей свойствами молекулярного сита, электрофорез накладывается на эффект сита, что приводит к улучшению разделения. Тедеско и др. [1283] приспособили для электрофореза колонку с сефадексом G-200, предназначенную для гель-фильтрации. Хорошее разделение в ней было достигнуто при фракционировании сыворотки крови и очистке галактозо-1-фосфат-уридилтра'нсферазы. Был разработан также метод гель-хроматографии в электрическом поле. По этому методу элюирующий раствор течет вниз, а полюс, к которому должны двигаться компоненты смеси в процессе электрофореза, располагается сверху. При этом электрофоретический ток замедляет движение определенных компонентов в дополнение к эффекту молекулярного сита, проявляющемуся в геле в отношении молекул меньшего размера.
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В СУСПЕНЗИИ АГАРОЗЫ ПО МЕТОДУ ИЕРТЕНА [564]
По этому методу электрофорез проводят в суспензии разведенного агарозного геля. Его концентрация может варьировать от 0,12 до 0,2%. Рекомендуется выбирать концентрацию немного выше той, которая требуется для предотвращения оседания пробы. Для приготовления поддерживающего материала необходимое количество агарозы размешивают в горячем буферном растворе, и эту смесь кипятят до полного растворения агарозы. Полученный раствор оставляют на ночь в закрытом сосуде при комнатной температуре. Образовавшуюся на поверхности пленку удаляют и осторожным помешиванием добиваются получения однородной суспензии. Нижний конец колонки закрывают диализной мембраной и при помощи перистальтического насоса колонку наполняют суспензией агарозы. Подлежащая разделению проба должна также содержать агарозу в той же кон-
центрации, что и в колонке. Пробу вносят в готовую колонку на оптимальной высоте при помощи присоединенной к шприцу тонкой капиллярной трубочки. По окончании электрофореза все содержимое колонки, т. е. суспензию агарозы вместе с разделившимися зонами, перистальтическим насосом переносят в пробирки коллектора фракций. Далее агарозу удаляют простым центрифугированием, желательно при 10000 g, но можно применять также и меньшие скорости. Необходимо отметить, что последние следы агарозы с трудом поддаются удалению.
1.9. Электрофорез в агаровом и агарозном гелях
1.9.1. Теория электрофореза в агаровом (агарозном) геле
ХИМИЯ АГАРА
Имеющийся в продаже агар выделен из клеточных мембран различных водорослей. Чистота и химический состав отдельных препаратов существенно различаются в зависимости от использованного источника и метода очистки. Точная структура агара неизвестна, но, по данным Араки [50], он содержит по крайней мере два полисахарида, а именно агарозу и агаропек-тин, которые можно легко отделить друг от друга после аце-тилирования благодаря тому, что только ацетат агарозы растворим в хлороформе. В агаре содержится около 6% сульфата главным образом в составе агаропектина. В чистой агарозе его содержание составляет лишь около 0,04%. Агар и агароза растворяются в водных растворах при нагревании в кипящей водяной бане, причем раствор остается жидким при снижении температуры примерно до 40 °С, а затем вязкость его резко возрастает и при 38 °С он застывает. После этого агар можно растворить снова только в кипящей водяной бане.
Агаровый гель механически прочен. После высушивания он превращается в прозрачную пленку, которую удобно фотомет-рировать оптическими методами и легко хранить не повреждая. Сам по себе агар является дешевым и нетоксичным материалом. Благодаря своим полезным свойствам агар и особенно агароза широко используются в биохимии в качестве поддерживающей среды при электрофорезе главным образом для исследования макромолекул.
СТРУКТУРА И СВОЙСТВА геля
В форме геля агар содержит поры различных размеров, причем средний радиус пор зависит от его концентрации [6] (рис. 18). Поры достаточно велики, поэтому при электрофоретическом разделении белков в гелях с концентрацией агара ниже 2% эффект молекулярного сита обычно ничтожен [1419]. Лишь такие крупные молекулы, как ДНК [1269] и РНК [498, 852, 1308], разделяются в агаровом геле в соответствии с их размерами, вероятно, вследствие фильтрующего эффекта геля. Было :показано [1308], что подвижность молекул РНК связана об-
ратной зависимостью с корнем квадратным из концентрации агара (б’) согласно уравнению
и=и0( 1-kVt). (1>
где Uо—подвижность в свободной среде и U — подвижность РНК в агаровом геле данной концентрации. Авторы высказали предположение, что отставание молекул РНК нельзя полностью объяснить на основе эффекта молекулярного сита и что оно,, возможно, возрастает вследствие соударений цепей РНК с агаром. Число таких соударений также, видимо, является вероятностной функцией радиуса пор.
Задержка фибриногена и р-липопротеидов в агаровом геле обусловлена их выпадением в осадок, а не эффектом молекулярного сита, так как эти вещества нормально движутся в геле, если в них предварительно заблокировать сульфатные группы [584].
Поскольку агар содержит значительное количество отрицательно заряженных групп, преимущественно сульфатных и карбоксильных, агаровый гель обладает некоторыми ионообменными свойствами. Однако его емкость, по-видимому, низка, потому что он обычно используется в концентрации около 1%. Тем не менее положительно заряженные белки могут обнаруживать некоторое сродство по отношению к отрицательно заряженным группам агара, что проявляется в растягивании (tailing) зоны, если связывание обратимое, или в ее задержке (trailing), если связывание необратимое (рис. 19).
