Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Заряженные группы агара не могут перемещаться в электрическом поле, так как они иммобилизованы переплетающимися нитями геля.
Вследствие этого возникает ток воды (электроосмотиче-ский ток), направленный в противоположную сторону, г. е. к катоду. Сам по себе этот ток не мешает разделению веществ, но иногда созда-ет трудности при расчете подвижности молекул в свободной среде. Скорость электроосмоса зависит от многих па-
Рис. 18. Измерение эффективного радиуса пор в зависимости от концентрации агарового геля [6]. О радиусы* рассчитанные на основании результатов опытов с гемоглобином; ф радиусы, рассчитанные из результатов опытов с вирусом южной мозаик» фасоли.
р а метров, таких, как условия проведения электрофореза, ионная сила, температура, а также концентрация, чистота и срок хранения агарового геля. Воспроизводимые результаты можно получить в том случае, если гели используются в течение примерно 24 ч после их застывания [1419]. О величине электроосмоса судят по расстоянию между линией нанесения пробы и положением незаряженных молекул (декстран, витамин В12, глюкоза и т. д.) после электрофореза.
Электроосмотическ и й ток можно уменьшить, используя препараты агара, содержащие малые количества заряженных групп. Согласно данным ряда авторов [50, 171, 561], агароза как среда для элект-
рофореза имеет преимущества перед агаром, так как в агарозном геле величина электроосмоса мала, а (S-лшюпротеиды не выпадают в осадок. Однако последующие исследования показали, что получить агарозу, свободную от заряженных групп, очень трудно, а может быть, и совсем невозможно. Эти группы не удается полностью удалить ни хроматографическими, ни электрофоретическими методами [318, 319, 631, 1044]. В последних работах приводятся данные, что агарозу и даже агар можно освободить от отрицательно заряженных групп путем химической модификации, а именно обработкой щелочью, которая гидролизует сульфатные группы и, вероятно, удаляет некоторые заряженные полисахариды с относительно низкой молекулярной массой [731, 1023].
Электрооомос может стать серьезной проблемой, если он вызывает появление гидростатического давления, особенно в тех случаях, когда для соединения геля с буфером в электродных сосудах попользуется фильтровальная бумага, неспособная пропускать сравнительно большое количество воды, движущейся к катоду. На аноде же бумага теряет воду и может высох-
Рис. 19. Растягивание (Л) и задержка (?) зон белков при электрофорезе.
нуть. Этот процесс нарушает условия протекания электрофореза и приводит к искажениям результатов опыта.
Образование тепла в процессе электрофореза вызывает изменение вязкости, проводимости и окорости диффузии, а также способствует испарению летучих компонентов. Поэтому для получения воспроизводимых результатов необходим контроль за температурой.
1.9.2. Аналитический электрофорез в агаровом (агарозном) геле
МЕТОДИКА И ПРИБОРЫ
Очистка агара. Агар можно очистить, промывая гель дистиллированной водой [461].
Порошок агара растворяют в дистиллированной воде в кипящей водяной бане и доводят его концентрацию до 6%. Горячий раствор фильтруют и переливают в химический стакан. После застывания гель разрезают на кусочки размером около
1 ом и промывают не менее 48 ч при частой смене дистиллированной воды. Сухую массу определяют после высушивания. Затем гель вновь расплавляют в кипящей водяной бане и готовят 2,5%-ный исходный раствор. Для сохранности в него иногда добавляют мертиолат (0,01%).
Описаны и другие способы, позволяющие получить агар в более чистой форме [141, 660]. Агарозу можно приготовить из агара путем ацетилирования [50, 561] или при помощи осаждения сульфатсодержащих компонентов цетилпиридиниихлоридом [563]. Детальные описания этих приемов очистки приводятся в оригинальных статьях, а также в прекрасном обзоре Виме [1419].
Методы снижения содержания сульфата в агарозе или агаре. Как уже отмечалось в теоретической части, даже агароза содержит сульфатные группы, участвующие в ионном обмене и ответственные за электроосмотический ток. Сульфаты и, возможно, другие отрицательно заряженные группы можно удалить из агара или агарозы обработкой щелочью [731]. В двухлитровую круглую иолбу, снабженную обратным холодильником и магнитной мешалкой, наливают 200 мл водного раствора, содержащего 100 г NaOH и 1,2 г NaBH4. Колбу помещают в масляную баню. При непрерывном перемешивании в раствор добавляют 20 г агара и доводят температуру бани до 80 °С, Спустя 2 ч температуру снижают до 50°С и раствор агара нейтрализуют, добавив к нему примерно 150 мл концентрированной уксусной кислоты. Полученный раствор небольшими порциями при энергичном перемешивании вливают в трехлитровую круглую колбу, снабженную пропеллерной мешалкой и содер-
жащую 2 л изопропанола, предварительно охлажденного в ледяной бане до температуры ниже 10 °С. При этом температура реакционной смеси не должна превышать 20 °С. Выпавший в осадок агар в виде гранулярно-волокнистой массы отмывают водой на воронке со стеклянным фильтром или на воронке Бюхнера и лиофилизируют. Выход составляет 85—90%.
